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Master's Dissertation
DOI
Document
Author
Full name
Veronica Lippi Oliveira da Silva
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2019
Supervisor
Committee
Quintana, Victor Hugo Aquino (President)
Guazzaroni, María Eugenia
Kress, Marcia Regina von Zeska
Modena, José Luiz Proença
Title in Portuguese
Desenvolvimento de RT-PCR em tempo real para diagnóstico diferencial de chikungunya, dengue e Zika
Keywords in Portuguese
Alfavírus
Arbovírus
Chikungunya
Dengue
Diagnóstico
Flavivírus
RT-PCR em tempo real
SYBR Green,. Sonda
Zika
Abstract in Portuguese
As doenças causadas pelos vírus da chikungunya (CHIKV), dengue (DENV) e Zika (ZIKV), principalmente na fase aguda, induzem sintomatologias muito semelhantes entre si. O CHIKV pertence ao gênero Alphavirus da família Togaviridae, enquanto os DENV e ZIKV pertencem ao gênero Flavivirus da família Flaviviridae. A rápida implementação de tratamento, especialmente nos pacientes com dengue, diminui drasticamente o número de casos fatais. O objetivo deste trabalho foi desenvolver métodos de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) em tempo real para diagnóstico diferencial e precoce de chikungunya, dengue e Zika. Sondas e primers específicos para CHIKV, ZIKV e os quatro sorotipos de DENV (DENV-1 a -4) foram desenhados a partir dos primeiros nucleotídeos da extremidade 5' dos genomas virais para amplificação de fragmentos com 150, 185 e 170 pares de bases para DENV, ZIKV e CHIKV, respectivamente. Diversos protocolos foram realizados para otimização da reação de RT-PCR em tempo real considerando as concentrações de sondas, íon magnésio e temperatura de anelamento de sondas e primers. Análises de reação cruzada mostraram que os primers e as sondas selecionadas foram altamente específicos para os vírus em questão, sem reconhecimento cruzado de outros flavivírus e alfavírus, com exceção das sondas para os DENV-3 e DENV-4 que apresentaram reação cruzada com outros sorotipos. A sonda para DENV-3 reconheceu cruzadamente o DENV-1 e a sonda para DENV-4 o DENV-2. O limite de detecção da RT-PCR para dengue com sondas foi de 9,90x104, 2,42x102, 6,55x106 e 3,70x106 cópias/mL para os DENV-1 a -4, respectivamente. Contudo, o limite de detecção da RT-PCR para dengue com SYBR Green foi de 9,90x101, 2,42x101, 6,55x103 e 3,70x101 cópias/mL para os DENV-1 a -4, respectivamente, inferior àquela utilizando sondas. Os limites de detecção da RT-PCR com sondas para o ZIKV e o CHIKV foram de 1,25x100 e 5,25x100 PFU/mL, respectivamente, similares aos resultados encontrados quando realizada a RT-PCR com SYBR Green para estes mesmos vírus que foram de 1,25x101 e 5,25x100 PFU/mL, respectivamente. Amostras de soro de indivíduos assintomáticos e amostras de soro, urina ou saliva armazenadas no biorrepositório "Banco de amostras de arbovírus" (FCFRP Nº 006) do Laboratório de Virologia da FCFRP-USP, foram testadas com a RT-PCR com SYBR Green para dengue, observando-se uma sensibilidade de 54%, especificidade de 100%, valores preditivos positivo e negativo de 100% e 75%, respectivamente. Entretanto, quando avaliadas apenas as amostras de soro, observou-se uma sensibilidade de 82%, especificidade de 100%, valores preditivos positivo e negativo de 100% e 71% respectivamente, sugerindo que as amostras de soro são as mais indicadas para utilização no diagnóstico da dengue. Estas amostras também foram analisadas com as RT-PCRs com sondas para os vírus chikungunya e Zika, sendo todas negativas. As amostras detectadas com a RT-PCR com SYBR Green para dengue foram analisadas com a RT-PCR com sondas, sendo observada uma concordância de mais de 90% com os sorotipos previamente identificados. Conclui-se, portanto, que a detecção diferencial dos vírus é eficaz e fiel em uma única etapa e o método possui alta especificidade e sensibilidade
Title in English
Development of real time RT-PCR for the differential diagnosis of chikungunya, dengue and Zika
Keywords in English
Alfavirus
Arbovirus
Chikungunya
Dengue
Diagnosis
Flavivirus
Probes
Real time RT-PCR
SYBR Green
Zika
Abstract in English
Diseases caused by the viruses chikungunya (CHIKV), dengue (DENV) and Zika (ZIKV), specially in the acute phase, induced very similar symptoms. The CHIKV belongs to de genus Alphavirus, family Togaviridae, while the DENV and ZIKV belong to the genus Flavivirus, family Flaviviridae. The aim of this work was to develop a real time reverse transcription followed by polymerase chain reaction (RT-PCR) for early and differential diagnosis of chikungunya, dengue and Zika. Specific primers and probes for CHIKV, ZIKV and the four DENV (DENV-1 a -4) serotypes were designed from the first nucleotides on the 5'end of the viral genomes to amplify fragments 150, 185, 170 base pairs fragments for DENV, ZIKV and CHIKV, respectively. Several protocols were analyzed for the optimization of the real time RTPCR, considering probes concentrations, magnesium ion and the primers and probes annealing temperature. Cross-reactivity tests showed that the selected primers and probes were highly specific to the target virus without recognition of other flaviviruses and alphaviruses, except for the probes for DENV-3 and DENV-4, which showed cross-reaction with other serotypes. The probe for DENV-3 cross-reacted with DENV-1 and the probe DENV-4 with DENV-2. The limit of detection of the RT-PCR with probes for dengue was 9,90x104, 2,42x102, 6,55x106 and 3,70x106 copies/mL for DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4, respectively. However, the limit of detection of the RT-PCR with SYBR Green for dengue was 9,90x101, 2,42x101, 6,55x103 and 3,70x101 copies/mL for DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4 respectively. The limit of detection of the RT-PCR with probes for ZIKV and CHIKV was 1,25x100 and 5,25x100 PFU/mL, respectively, similar to that found for the RT-PCR with SYBR Green, which was 1,25x101 e 5,25x100 PFU/mL for ZIKV and CHIKV, respectively. Serum samples from asymptomatic participants and serum, urine and saliva samples stored at the samples biorepository named "Banco de amostras de arbovírus" (FCFRP Nº 006) of the FCFRP-USP Virology laboratory were tested with RT-PCR with SYBR Green for dengue and showed a 54% sensitivity, 100% specificity and 100% and 75% positive and negative predictive values, respectively. However, when only serum samples were analysed, it showed 82% sensitivity, 100% specificity and 100% and 71% positive and negative predictive values, respectively, suggesting that the serum samples are more suitable for dengue diagnosis. Those samples were also analyzed with the RT-PCR with probes for CHIKV and ZIKV, being all negatives. The samples detected with the RT-PCR with SYBR Green for dengue were analyzed with the RTPCR with probes, showing to detect the expected serotype in more than 90% of them. Therefore, it's concluded that differential virus detection is effective and faithful in a single step and the method has high specificity and sensitivity
 
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Release Date
2021-09-03
Publishing Date
2019-11-19
 
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