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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.60.2009.tde-19022009-131003
Document
Author
Full name
Lizziane Kretli Winkelstroter
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2009
Supervisor
Committee
Martinis, Elaine Cristina Pereira de (President)
Falcão, Juliana Pfrimer
Oliveira, Carlos Augusto Fernandes de
Title in Portuguese
Quantificação e análise de viabilidade de Listeria monocytogenes em biofilmes por semeadura em placa, microscopia de fluorescência e ensaios preliminares de PCR em tempo real
Keywords in Portuguese
bactérias láticas
biofilmes
CTC-DAPI
Listeria monocytogenes
PCR em tempo real
Abstract in Portuguese
A formação de biofilmes é um fator preocupante para indústria de alimentos, pois pode comprometer a sanitização de superfícies de contato e aumentar o risco de contaminação por patógeno em alimentos processados. L. monocytogenes é uma bactéria de ampla distribuição no ambiente e com capacidade de formar biofilmes e sobreviver por longos períodos em condições adversas. Esta bactéria pode causar doenças em pessoas imunocomprometidas e mulheres grávidas manifestando-se por infecções do sistema nervoso central, abortos e nascimentos prematuros. Vários estudos têm demonstrado que algumas bactérias podem sofrer transição para o estado viável mas não cultivável em resposta ao estresse. Considerando-se a importância da garantia da segurança e qualidade dos alimentos, há necessidade de desenvolvimento e de padronização de técnicas rápidas para a quantificação de células viáveis de L. monocytogenes em alimentos e biofilmes. Neste estudo foi avaliada a formação de biofilmes e viabilidade celular de Listeria monocytogenes em condições de estresse. Foram utilizadas técnicas de semeadura em placa e quantificação direta por microscopia de fluorescência com os corantes cloreto de 5-ciano-2,3-di-(p-tolil) tetrazólio (CTC) e 4,6-diamino-2- fenilindol (DAPI). Foram também realizados ensaios preliminares para padronização da Reação da Polimerase em Cadeia em tempo real (PCR em tempo real) com amostras previamente tratadas com brometo de etídio monoazídico (EMA). Os resultados obtidos demonstraram que o método de semeadura em placa foi adequado somente para a enumeração de células viáveis de L. monocytogenes em biofilmes enquanto que o método de enumeração por microscopia de fluorescência com CTC-DAPI permitiu quantificar bactérias no estado viável e viável mas não cultivável. Também foi observado que a presença de bacteriocinas de L. sakei 1 e L. mensenteroides 11 causou a diminuição na viabilidade e formação de biofilmes por L. monocytogenes. Os resultados preliminares utilizando culturas puras de L. monocytogenes demonstraram que o tratamento com brometo de etídio monoazídico (EMA) antes da análise por PCR em tempo real reduziu a amplificação do DNA de células mortas em 1 log de UFC por mL. No entanto dependendo da concentração utilizada, pode ocorrer também a inibição da amplificação de células viáveis de L. monocytogenes. Os resultados do presente trabalho indicaram que a microscopia de fluorescência é comparável à placa para análise de células de L. monocytogenes não estressadas. Entretanto, para a quantificação de L. monocytogenes submetida a estresse, é desejável a utilização de corantes de viabilidade celular. O método de PCR em tempo real com pré-tratamento com EMA é promissor mas, ainda necessita de maior padronização para avaliação de sua aplicabilidade na determinação seletiva de células viáveis de L. monocytogenes.
Title in English
Quantification and viability analysis of Listeria monocytogenes biofilms by plate count, fluorescence microscopy and preliminary assays of real-time PCR.
Keywords in English
biofilms
CTC-DAPI
lactic acid bacteria
Listeria monocytogenes
real time PCR
Abstract in English
Biofilm formation is of great concern for food industry because it may compromise sanitization of surfaces and increase contamination risk of processed foods by bacterial pathogens. L. monocytogenes is an ubiquitous bacterium which is able to form biofilms and to survive for long periods under adverse conditions. L. monocytogenes may cause disease in immunocomprommised people and pregnant women, manifesting as central nervous system infections, abortion and premature birth. Some bacteria can undergo transition to viable but non-cultivable state in response to stress and it is important to study techniques for rapid quantification of viable cells of L. monocytogenes in foods. In this study biofilm formation and cell viability of Listeria monocytogenes were studied in stress conditions by plate counting, direct quantification by fluorescence microscopy with double staining dyes 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)/4'-6 diamino-2 phenylindole (DAPI). Preliminary experiments with real time polymerase chain reaction and treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) were also performed. The results showed that plate count method was suitable for enumeration only of viable cells of L. monocytogenes in biofilms since, fluorescence microscopy with CTC-DAPI yielded higher counts, probably due to the presence of viable but nonculturable cells. It was also observed that the presence of bacteriocins of L. sakei 1 and L. mensenteroides 11 decreased viability and formation of biofilm by L. monocytogenes. Results obtained with pure cultures of L. monocytogenes showed that the treatment with ethidium bromide monoazide (EMA) before real time PCR detection, reduced DNA amplification of dead cells in 1 log CFU per mL, but depending on the concentration used, EMA also inhibited amplification of viable cells of L. monocytogenes. The results indicated that plate counting and fluorescence microscopy are equivalent for enumeration of non-stressed L. monocytogenes cells. However, the use of double staining with fluorescence microscopy is a more suitable method if stressed cells are present. The EMA-real time PCR is a promissing tool for rapid evaluation of viable L. monocytogenes, but it needs further standartization.
 
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Publishing Date
2009-07-24
 
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