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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2018.tde-22052018-162051
Document
Auteur
Nom complet
Raquel Rinaldi Russo
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2017
Directeur
Jury
Quintana, Victor Hugo Aquino (Président)
Figueiredo, Luiz Tadeu Moraes
Natsui, Ana Patricia Yatsuda
Oliveira, Eduardo Brandt de
Santos, Wagner Ferreira dos
Titre en portugais
Produção e atividade antiviral das isoformas da fosfolipase A2 crotoxina B recombinante
Mots-clés en portugais
Antiviral
Dengue
Febre amarela
Fosfolipase A2
Produção recombinante
Venenos de serpentes
Resumé en portugais
O vírus da dengue (DENV) e o vírus da febre amarela (YFV) (gênero Flavivirus, família Flaviviridae) representam importantes arbovírus causadores de doenças em humanos que afetam as regiões tropicais e sub-tropicais do planeta, somando milhões de infectados anualmente. Embora exista uma vacina contra o YFV, ainda são notificados muitos casos de febre amarela nas regiões endêmicas das Américas e, principalmente, da África. Recentemente, foi licenciada uma vacina contra o DENV, mas seu uso ainda é bastante restrito. Não existem agentes terapêuticos para tratamento da infecção contra nenhum desses vírus. Portanto, estudos para identificação de fármacos para combaterem a infecção pelos DENV e YFV são de suma importância. Nosso grupo descreveu a ação antiviral da fosfolipase A2 crotoxina B (PLA2-CB) da serpente Crotalus durissus terrificus, a qual tem ação diretamente sobre o envelope de DENV e YFV. A meta principal deste trabalho foi a produção das duas isoformas da PLA2-CB (CB1 e CB2) recombinantes e avaliação de suas atividades antivirais, a fim de contribuir com a prospecção de novas drogas antivirais. Para alcançar tais propósitos, as sequências codificadoras das isoformas foram otimizadas para expressão em sistema procarioto, quimicamente sintetizadas e enzimaticamente inseridas no vetor de expressão pGS-21a. Os plasmídeos gerados foram utilizados para transformar células E. coli das cepas BL21(DE3), Origami B(DE3) e ArcticExpress (DE3). As proteínas recombinantes foram expressas juntamente com uma cauda de polihistidina (6xHis) no extremo C-terminal (CB1+6xHis_opt e CB2+6xHis_opt). Ambas as proteínas foram reconhecidas por anticorpos produzidos contra a PLA2-CB in natura em ensaio de Western Blot. Considerando que as proteínas foram expressas de forma insolúvel, a purificação foi realizada em sistema de cromatografia líquida (FPLC), utilizando coluna com resina de afinidade por níquel sob condições desnaturantes, utilizando ureia como agente solubilizador. As proteínas foram renaturadas na própria coluna de níquel (on-column) durante a purificação, utilizando um gradiente decrescente de ureia (6-0M - 120ml - 0,1ml/min) e o detergente CHAPS como agente estabilizador. As proteínas CB1+6xHis_opt e CB2+6xHis_opt em ensaio colorimétrico de hidrólise de fosfatidilcolina apresentaram atividade fosfolipásica, indicando preservação do sítio catalítico. Em ensaio virucida contra o DENV-2, YFV e outros dois vírus envelopados: Vírus Chikungunya (CHIKV) e vírus Zika (ZIKV), as proteínas recombinantes reduziram a formação de placas de lise exibindo índices de seletividade na média de 0,6. As proteínas CB1+6xHis_opt e CB2+6xHis_opt podem vir a ser um importante modelo na prospecção de novas drogas antivirais e como ferramenta no estudo do mecanismo de replicação viral.
Titre en anglais
Production and antiviral activity of phospholipase A2 crotoxin B recombinant isoforms
Mots-clés en anglais
Antiviral
Dengue
Phospholipase A2
Recombinant protein production
Snake venoms
Yellow fever
Resumé en anglais
Dengue virus (DENV) and yellow fever virus (YFV) (genus Flavivirus, family Flaviviridae) are important arboviruses that cause diseases in humans affecting the tropical and subtropical regions of the planet with millions of infected annually. Although there is a vaccine against YFV, many cases of yellow fever are still reported in the endemic regions of the Americas, and especially in Africa. A vaccine against DENV has recently been licensed, but its use is still quite restricted. There are no therapeutic agents to treat the infection against any of these viruses. Therefore, studies to identify drugs to combat DENV and YFV infection are of extreme importance. Our group described the antiviral action of the phospholipase A2 crotoxin B (PLA2-CB) isolated from Crotalus durissus terrificus, which acts directly on the envelope of DENV and YFV. The aim of this study was to produce the two recombinant PLA2-CB (CB1 and CB2) isoforms and evaluate their antiviral activities in order to contribute to the prospection of new antiviral drugs. To achieve such purposes, the coding sequences of the isoforms were optimized for prokaryotic expression system, chemically synthesized and enzymatically inserted into the pGS-21a vector. The plasmids generated were used to transform E. coli cells from BL21 (DE3), Origami B (DE3) and ArcticExpress (DE3) strains. Recombinant proteins were expressed tagged with a polyhistidine (6xHis) tail at the C-terminus (CB1+6xHis_opt and CB2+6xHis_opt). Both proteins were recognized by antibodies raised against native PLA2-CB in Western blot assay. Considering that the proteins were expressed in insoluble form, purification was performed in liquid chromatography system (FPLC) using nickel resin column under denaturing conditions, using urea as the solubilizing agent. The proteins were renatured on-column during purification procedure using a decreasing gradient of urea (6-0M - 120ml - 0,1ml/min) and CHAPS as a stabilizing agent. CB1+6xHis_opt and CB2+6xHis_opt proteins showed phospholipase activity in a colorimetric assay based on phosphatidylcholine hydrolysis, indicating preservation of the catalytic site. In a virucidal assay against DENV-2, YFV and two other enveloped viruses: Chikungunya virus (CHIKV) and Zika virus (ZIKV), the recombinant proteins reduced the plaques of lysis formation exhibiting selectivity indices at the mean of 0.6. The CB1+6xHis_opt and CB2+6xHis_opt proteins could be important models for the prospection of new antiviral drugs and as tools for the study of the mechanism of viral replication.
 
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Date de Libération
2020-05-21
Date de Publication
2018-07-27
 
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