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Tese de Doutorado
DOI
Documento
Autor
Nome completo
Ana Flavia Tonelli Fernandes
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2018
Orientador
Banca examinadora
Stehling, Eliana Guedes (Presidente)
Cabral, Hamilton
Guazzaroni, María Eugenia
Martinis, Elaine Cristina Pereira de
Savazzi, Eduardo Angelino
Título em português
Atrazina: biodegradação e efeitos na comunidade bacteriana do solo
Palavras-chave em português
Atrazina
Biodegradação
Expressão dos genes atz
Metataxonômica.
qPCR
Resumo em português
A atrazina, um herbicida triazínico amplamente utilizado no controle de ervas daninhas, é um potencial contaminante ambiental, e possui como principal via de degradação uma via biológica. A linhagem Pseudomonas sp. ADP é o micro-organismo de referência no processo de degradação da atrazina em ambientes contaminados, pois contém em seu genoma os genes atzA, atzB, atzC, atzD, atzE e atzF, os quais codificam as enzimas responsáveis pelo processo de degradação. Bactérias gram-positivas também possuem capacidade para degradar a atrazina, mas iniciam a via de degradação através do gene trzN, análogo ao atzA. O objetivo do presente trabalho foi obter e analisar isolados bacterianos e consórcios formados por duas ou mais bactérias com capacidade para degradação completa do herbicida atrazina, como também analisar os efeitos da atrazina na comunidade bacteriana do solo. Duas bactérias gram-negativas, A01 e A02, foram isoladas de amostras de solo e foram identificadas como pertencentes aos gêneros Achromobacter e Pseudomonas, respectivamente, através do sequenciamento do gene 16S rRNA. Ambos os micro-organismos apresentaram potencial para biodegradação da atrazina em meio sólido, mas somente o isolado Pseudomonas sp. apresentou todos os genes atzA, atzB, atzC, atzD, atzE e atzF, que codificam as enzimas da via completa de degradação da atrazina. O isolado Achromobacter sp. apresentou somente os genes atzA, atzB e atzC, que representam a via inicial de degradação da atrazina até a formação de ácido cianúrico como metabólito. Um ensaio utilizando o método Southern Blot foi realizado para verificar se os genes atz detectados nos isolados do estudo são plasmidiais, sendo que apenas o isolado Pseudomonas sp. apresentou plasmídeo. A expressão dos genes atzA, atzB, atzC e atzD foi avaliada pelo método Northern Blot, contudo apenas o isolado Pseudomonas sp. apresentou expressão diferencial após tratamento com atrazina. Análises em HPLC/DAD e LC-MS/MS demonstraram que o isolado Pseudomonas sp. apresenta um perfil de degradação da atrazina semelhante ao perfil do micro-organismo padrão Pseudomonas sp. ADP, sendo apto a degradar 99% de atrazina in vitro em 24 horas. Já o isolado Achromobacter sp. apresentou um perfil de degradação lento, com início do processo após 24 horas. Os três metabólitos iniciais formados pela degradação da molécula de atrazina foram detectados em amostras contendo tanto o isolado Pseudomonas sp. quanto o isolado Achromobacter sp. O consórcio bacteriano composto pelos dois isolados deste estudo não apresentou eficiência de degradação superior às culturas puras. Por fim, um experimento de campo foi realizado com o objetivo de analisar os efeitos da atrazina na comunidade bacteriana do solo. O herbicida atrazina foi aplicado ao solo e amostras foram coletadas para análise através das técnicas de qPCR e Sequenciamento de Nova Geração. Foi possível observar que a abundância dos genes responsáveis pelo início da via de degradação da atrazina se altera ao longo do tempo, sendo que o aumento mais expressivo foi observado no gene trzN, comumente encontrado em bactérias gram-positivas com capacidade para degradar a atrazina. O sequenciamento do gene 16S rRNA indicou que a aplicação de atrazina ao solo não provocou mudanças significativas na comunidade bacteriana. As amostras apresentaram alta diversidade antes e após o tratamento com atrazina e a análise ii da abundância relativa mostrou pequenas diferenças na abundância de famílias após quatro e oito semanas de aplicação da atrazina ao solo. Assim, é possível sugerir que a aplicação do herbicida atrazina ao solo nas doses recomendadas não provoca danos significativos na estrutura da comunidade bacteriana do solo.
Título em inglês
Atrazine: biodegradation and effects on soil bacterial community
Palavras-chave em inglês
Atrazine
Atz gene expression
Biodegradation
Metataxonomic
qPCR
Resumo em inglês
Atrazine, a triazine herbicide widely used to control broadleaf weeds, is a potential contaminant of soils, groundwater, rivers, lakes and oceans. Its main route of degradation is a biological pathway. Pseudomonas sp. ADP is a standard bacterium in the process of atrazine mineralization in contaminated environments, because it possesses a plasmid that contains the genes atzA, atzB, atzC, atzD, atzE and atzF, which encode the enzymes responsible for the atrazine degradation process. Gram-positive bacteria also have the ability to degrade atrazine, but the degradation starts through the trzN gene, wich is analogue to atzA. The aim of the present work was to obtain and analyze a bacterial isolate or a consortium formed by two or more bacteria capable of completely degrade the herbicide atrazine and to analyze the effects of atrazine on the soil bacterial community. Two gram-negative microorganisms, A01 and A02, were isolated from soil samples and were identified as Achromobacter sp. and Pseudomonas sp., respectively, through the sequencing of the 16S rRNA gene. Both microorganisms showed potential to degrade atrazine on solid medium, but only the isolate Pseudomonas sp. presented the genes atzA, atzB, atzC, atzD, atzE and atzF that are essential for the biodegradation process. Achromobacter sp. presented only the atzA, atzB and atzC genes, which represent the initial pathway of atrazine degradation that leads to the formation of cyanuric acid. An assay using Southern Blot was performed to verify if the atz genes detected in the isolates were located on plasmid, however only Pseudomonas sp. showed a plasmid. The atz gene expression was evaluated through Northern Blot methodology, but only Pseudomonas sp. showed differential expression after atrazine induction. Analyzes in HPLC/DAD and LC-MS/MS demonstrated that the isolate Pseudomonas sp. presents an atrazine degradation profile similar to the profile of Pseudomonas sp. ADP and is capable of degrading 99% of atrazine in vitro. The strain Achromobacter sp. presented a slow degradation profile and started the degradation process after 24 hours of incubation. The three initial metabolites formed after atrazine degradation were detected in samples containing both Pseudomonas sp. and Achromobacter sp. The bacterial consortium composed of the two isolates of this study did not show higher degradation efficiency than pure cultures. Lastly, a field experiment was performed in order to study the effects of atrazine on the soil bacterial community. The herbicide atrazine was applied to the soil and samples were collected to be analysed using qPCR and Next Generation Sequencing. It was possible to observe that the abundance of the atz genes that initiate the degradation process is changed over time. A significant increase was observed on trzN, which is commonly found in gram-positive bacteria that is capable of degrading atrazine. 16S rRNA gene sequencing indicated that atrazine application to soil do not cause significant changes in the bacterial community. Soil samples presented high diversity before and after atrazine treatment and the relative abundance analysis showed slight differences in families abundance after four and eight weeks of atrazine application to soil. Therefore, the results suggest that the use of atrazine in recommended doses does not cause significant damage to the structure of the soil bacterial community.
 
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Data de Liberação
2021-05-21
Data de Publicação
2019-07-11
 
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