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Master's Dissertation
DOI
Document
Author
Full name
Péricles Natan Mendes da Costa
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2017
Supervisor
Committee
Haddad, Simone Kashima (President)
Orellana, Maristela Delgado
Deffune, Elenice
Rosa, Adalberto Luiz
Title in Portuguese
Caracterização de células mesenquimais-like diferenciadas a partir de células-tronco humanas de pluripotência induzida
Keywords in Portuguese
caracterização
imunomodulação
iPSC
MSC-like
proliferação
UC-MSC
Abstract in Portuguese
As células-tronco de pluripotência induzida (iPSC) representam uma fonte de maior disponibilidade para obtenção de células estromais mesenquimais (MSC). Além disso, as células mesenquimais derivadas de iPSC, as MSC-like, demonstram in vitro uma atividade parácrina e uma taxa de proliferação que as apontam como uma candidata em potencial à terapia celular. Em paralelo, a terapia celular dispõe das propriedades terapêuticas das células estromais mesenquimais do cordão umbilical (UC-MSC), uma população celular de fácil isolamento, rendimento notável, alta capacidade de proliferação e ausência de tumorigenecidade. Assim, perante a relevância das iPSC como fonte alternativa para obtenção de MSC e do desempenho in vitro demonstrado pelas MSC-like, tornou-se necessário a comparação destas com as UC-MSC. Para tanto, iPSC reprogramadas a partir de células mononucleares do sangue periférico (iPS-PBMC) foram diferenciadas em MSC-like e estas por sua vez foram caracterizadas, segundo à aderência ao plástico, expressão de genes e proteínas de pluripotência, expressão de antígenos de superfície CD73, CD90, CD105, CD14, CD19, CD34, CD45 e HLA-DR; capacidade de diferenciação in vitro em adipócitos e osteócitos e posteriormente comparadas as UC-MSC frente a capacidade de proliferação e imunomodulação. As MSC-like obtidas mostraram-se aderentes ao plástico, não pluripotentes e com morfologia fibroblastoide. Demonstraram um perfil imunofenotípico negativo (menos de 2% de células positivas) para marcadores hematopoéticos e HLA-DR, mais de 90% para CD73 e CD90 e menos de 80% para CD105. Ademais, exibiram capacidade de diferenciação osteogênica e adipogênica. Quando comparadas às UC-MSC, em relação à capacidade de proliferação, as MSC-like apresentaram uma taxa de proliferação duas vezes menor. A comparação da capacidade imunomodulatória entre as duas linhagens demonstrou que as UC-MSC foram capazes de conter a proliferação de linfócitos T CD8+ mas não de linfócitos T CD4+. As MSC-like não foram capazes de conter a proliferação de ambas as populações de linfócitos. Os resultados indicam que o protocolo de indução utilizado foi capaz de gerar MSC-like com antígenos de superfície clássico em mesenquimais, baixa expressão de marcadores de pluripotência, hematopoéticos e HLA-DR e com habilidade de se diferenciar em linhagens mesodérmicas, porém, com menor capacidade de proliferação e ausência de propriedades imunomodulatórias. A funcionalidade das MSC-like geradas neste trabalho pode ser proveniente de fatores genéticos e epigenéticos do doador e pelas metodologias de reprogramação da célula somática à iPSC, bem como pela indução da iPSC à MSC. A investigação futura destes fatores pode contribuir para a obtenção de MSC-like funcionalmente semelhante às UC-MSC.
Title in English
Characterization of differentiated mesenchymal-like cells from induced pluripotent stem cell
Keywords in English
characterization
immunomodulation
iPSC
MSC-like
proliferation rate
UC-MSC
Abstract in English
Induced pluripotent stem cells (iPSC) are an easily available mesenchymal stromal cell (MSC) source. Moreover, iPSC-derived mesenchymal cells (MSC-like) demonstrated an in vitro proliferation rate and paracrine activity that make them a potential candidate for cell therapy. Currently the cell therapy uses the therapeutic properties of umbilical cord-derived mesenchymal cells (UC-MSC), an effortlessly isolated cell population with remarkable yield, high proliferation capacity, and absence of tumorigenecity. Thus, considering the iPSC relevance as an alternative MSC source and their in vitro performance, it has become necessary to compare them with UC-MSC. The iPSC reprogrammed from peripheral blood mononuclear cells (iPS-PBMC) were differentiated in MSC-like and these cells were characterized according their adherence to plastic; pluripotency genes and proteins expression; surface antigens expression such CD73, CD90, CD105, CD14, CD19, CD34, CD45, and HLA-DR; in vitro differentiation capacity into adipocytes and osteocytes; and were compared with the UC-MSC proliferation and immunomodulation capacity. The obtained MSC-like were adherent to plastic, not pluripotent, and with fibroblastoid morphology. They demonstrated an immunophenotypic profile with less than 2% hematopoietic and HLA-DR positive cell markers, over 90% of CD73 and CD90, and less than 80% were CD105 positives. They also exhibited osteogenic and adipogenic differentiation capacity. When proliferation rate was compared between the two cell lineages, MSC-like showed a proliferation rate twice smaller than UC-MSC. The UC-MSC immunomodulatory activity contained the proliferation of T CD8+ lymphocytes but did not of T CD4+. MSC-like did not show immunomodulatory activity in the proliferation of CD4+ and CD8+. These results allow the assumption that the applied induction protocol was able to generate MSC-like with the classic mesenchymal surface markers, low pluripotency, hematopoietic, and HLA-DR surface markers expression and with mesodermal lineage differentiation potential, however, with lower proliferation rate and absence of immunomodulatory properties. The MSC-like functionality could be influenced by donor genetic and epigenetic factors as well as by as well as the methodologies of reprogramming of somatic cells to the iPSC and the induction of iPSC to the mesenchymal phenotype. These influential factors should be investigated in deep detail in order to make the generated MSC-like functionally similar to UC-MSC.
 
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Release Date
2019-11-24
Publishing Date
2017-12-08
 
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