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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.60.2009.tde-26052009-161112
Document
Author
Full name
Roberto Antonio de Souza
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2009
Supervisor
Committee
Falcão, Juliana Pfrimer (President)
Andrade, Denise de
Martinez, Marina Baquerizo
Title in Portuguese
Identificação de linhagens atípicas de Yersinia spp. por métodos moleculares
Keywords in Portuguese
ERIC-PCR
linhagens atipicas
MLST
PFGE
Sequenciamento do gene 16S rRNA
Yersinia
Abstract in Portuguese
O gênero Yersinia compreende 12 espécies. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis são patógenos de vários animais, incluindo os humanos. Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. aleksiciae, Y. mollaretti e Y. rhodei são encontradas sobretudo no meio ambiente e alimentos e consideradas, usualmente, como bactérias oportunistas não-patogênicas e Y. ruckeri é um importante patógeno de peixes. Usualmente, as linhagens de Yersinia são classificadas em espécies de acordo com suas características bioquímicas. O Laboratório Nacional de Referência em Yersinia spp. outras que Y. pestis recebeu mais de 700 linhagens que foram identificadas bioquimicamente. Entretanto, sete linhagens de Yersinia não puderam ser identificadas pelos testes bioquímicos convencionais em nenhuma das espécies até o momento conhecidas e, por esse motivo, foram denominadas Yersinia atípicas. Os objetivos desse trabalho foram identificar as linhagens atípicas de Yersinia spp. em espécies por técnicas moleculares como Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE), sequenciamento do gene 16S rRNA e Multilocus Sequencing Typing (MLST) e definir dentre as metodologias empregadas a que mais contribui para a identificação precisa dessas linhagens. Foi estudado um total de 59 linhagens de Yersinia spp., sendo 52 linhagens representantes das diferentes espécies do gênero e sete as linhagens bioquimicamente atípicas de Yersinia. As técnicas de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e o MLST foram eficientes na identificação molecular do gênero Yersinia, uma vez que conseguiram reunir todas as espécies em ramos espécie-específicos, com exceção de algumas linhagens de Y. frederiksenii e Y. kristensenii. A técnica de PFGE, pelo contrário, não agrupou as linhagens estudadas em clusters espécie-específicos. Os dados de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e MLST, sugerem que as linhagens atípicas FCF 229 e FCF 231 pertençam à espécie Y. ruckeri. Os dados de ERIC-PCR e MLST sugerem que a linhagem atípica FCF 487 pertença à espécie Y. enterocolitica. Ademais, os dados de ERIC-PCR, sequenciamento do gene 16S rRNA e MLST sugerem que as linhagens atípicas FCF 216, FCF 465, FCF 457 e FCF 494 pertençam a espécie Y. massiliensis. Os resultados obtidos nesse trabalho fornecem dados importantes para a caracterização molecular de linhagens bioquimicamente atípicas de Yersinia e contribuem para uma melhor descrição do gênero quanto a sua diversidade e reforçam o MLST como uma técnica confiável e reprodutível a ser usada na identificação de bactérias pertencentes a esse gênero, sendo dentre as metodologias utilizadas nesse estudo a mais indicada para tipagem molecular de yersiniae.
Title in English
Identification of atypical Yersinia strains by molecular methods
Keywords in English
16S rRNA gene sequencing and MLST
Atypical strains
ERIC-PCR
PFGE
Yersinia
Abstract in English
The genus Yersinia comprises 12 species. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis are pathogens of various animals, including humans. Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. aleksiciae, Y. mollaretti and Y. rohdei have been mostly found in the environment and food sources and are commonly considered to be opportunistic nonpathogenic bacteria and Y. ruckeri is an important fish pathogen. Usually, Yersinia strains are classified into species according to their biochemical characteristics. The Brazilian Reference Center on Yersinia spp. other than Y. pestis received more than 700 strains that were biochemically identified. However, seven strains that were typed as Yersinia could not be biochemically identified in any one of the currently known Yersinia species and for this reason they were named as atypical strains. The aims of this work were to identify into species the atypical Yersinia strains using molecular techniques as Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), 16S rRNA gene sequencing and Multilocus Sequencing Typing (MLST) and to define which methodology better contribute to the identification of those strains. A total of 59 Yersinia spp. strains were studied, being 52 representative strains of the defined Yersinia species and seven atypical Yersinia strains. ERIC-PCR, 16S rRNA gene sequencing and MLST were efficient in molecular identifying the genera Yersinia once they grouped the strains into species-specific clusters, with exception of some Y. frederiksenii and Y. kristensenii strains. However, PFGE was not capable to cluster the defined Yersinia strains into species-specific clusters. The data obtained by ERIC-PCR, 16S rRNA gene sequencing and MLST suggest that the atypical strains FCF 229 and FCF 231 belong to Y. ruckeri species. The data obtained by ERIC-PCR and MLST suggest that FCF 487 belong to the Y. enterocolitica species. Additionally, ERIC-PCR, 16S rRNA gene sequencing and MLST suggest that the atypical strains FCF 216, FCF 465, FCF 457 and FCF 494 belong to the Y. massiliensis species. The results obtained provide important data for the molecular characterization of biochemically atypical strains and contribute for a better description of the genera regardless its diversity. Furthermore, the results reinforce MLST as a trustful and reproducible technique to be used in the identification of bacteria of this genus, being among the methodologies studied the most recommended one to molecular type yersiniae.
 
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Publishing Date
2009-10-01
 
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