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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.60.2012.tde-26102012-162215
Document
Author
Full name
Fábio Alves Aguila
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2012
Supervisor
Committee
Rocha, Maria Jose Alves da (President)
Alves Filho, José Carlos Farias
Souza, Gloria Emilia Petto de
Title in Portuguese
Análise da concentração de nitrato no líquido cefalorraquidiano e da atividade enzimática das óxido nítrico sintases no hipotálamo de ratos submetidos à sepse experimental
Keywords in Portuguese
Ligadura e perfuração cecal
Óxido nítrico
Vasopressina
Abstract in Portuguese
Sepse é definida como uma resposta inflamatória sistêmica frente a um estímulo infeccioso. Na fase inicial da doença ocorre aumento da secreção de vasopressina (AVP) e na fase tardia observamos uma redução, apesar dos elevados níveis de mediadores inflamatórios e agravamento da hipotensão que são estímulos para a secreção do hormônio. O óxido nítrico (NO), produzido pela enzima óxido nítrico sintase (NOS), parece modular a secreção de AVP dependendo do contexto fisiopatológico. Durante sepse experimental nosso grupo demonstrou que as concentrações plasmáticas de nitrato, que servem como índice da produção de NO, se elevam progressivamente durante a evolução da doença, mas não há evidências de que isto ocorra também a nível central. Nosso objetivo foi avaliar temporalmente a concentração de nitrato no líquido cefalorraquidiano (LCR) e a atividade enzimática das NOS no hipotálamo de ratos submetidos à sepse por ligadura e perfuração cecal (CLP). Os procedimentos, aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Campus de Ribeirão Preto (CEUA-USP, protocolo nº 10.1.294.53.7), foram realizados com ratos Wistar pesando 250 ± 30 gramas, os quais foram divididos em dois grupos: CLP e operação fictícia (OF). Após 0, 2, 6 e 24 horas das cirurgias, foi feita a coleta do LCR para a determinação da concentração de nitrato pelo método de quimiluminescência NO/ozônio. Imediatamente após os animais foram decapitados para coleta de sangue utilizado para determinação de hematócrito, sódio sérico, proteína, interleucina (IL)-1?, nitrato e AVP plasmáticos. Também foram removidas as neurohipófises para análise do conteúdo de AVP e o hipotálamo para análise da atividade da NOS pelo método da Citrulina. Nos animais sépticos, as concentrações plasmáticas de AVP seguiram o padrão esperado, com aumento em 2h e 6h, retornando a níveis basais em 24h. Os estoques neurohipofisários de AVP reduziram em 2h e 6h retornando a níveis basais em 24h. O sódio sérico e as proteínas plasmáticas diminuíram 2h, 6h e 24h após CLP, e os hematócritos aumentaram nos mesmos períodos. As concentrações plasmáticas de IL-1? e nitrato aumentaram 6h e mantiveram-se elevadas 24h após CLP. Entretanto, no LCR o nitrato aumentou em 6h, mas retornou a níveis basais em 24h. A atividade hipotalâmica das NOS totais e constitutivas eram de 50 a 100 vezes maiores que as das NOS induzidas e aumentaram 6h e 24h após a CLP. Os resultados deste estudo mostram que as atividades das NOS observadas no hipotálamo ex vivo dos ratos sépticos indicam a presença de formas viáveis das enzimas, sendo a isoforma constitutiva a mais relevante para a produção de NO nesta região cerebral. Além disso, as alterações temporais das concentrações de nitrato no LCR diferem da de nitrato plasmático, revelando um perfil diferenciado da produção de NO central em relação à periférica, e que este pode estar relacionado à secreção bifásica de AVP na sepse
Title in English
Analysis of nitrate concentration in the cerebrospinal fluid and of the enzymatic activity of nitric oxide synthase in the hypothalamus of rats submitted to experimental sepsis.
Keywords in English
Cecal ligation and puncture
Nitric oxide
Vasopressin
Abstract in English
Sepsis is defined as a systemic inflammatory response to an infectious stimulus. In the initial phase of the disease the secretion of vasopressin (AVP) is increased and late is observed a reduction, although high levels of inflammatory mediators and worsening of the hypotension, which are stimuli for the hormone secretion. Nitric oxide (NO) produced by the enzyme nitric oxide synthase (NOS), appears to modulate the secretion of AVP depending on the pathophysiological context. During experimental sepsis our group demonstrated that the plasma nitrate concentrations, which serve as an index of NO production, increase gradually during the course of the disease. However, there is no evidence that this also occurs at the central level. Our aim was to evaluate the temporal nitrate concentration in the cerebrospinal fluid (CSF) and the enzymatic activity of NOS in the hypothalamus of rats submitted to sepsis by cecal ligation and puncture (CLP). The procedures, approved by the Ethics Committee on Animal Use of the Campus of Ribeirão Preto (CEUA - USP, Protocol nº10.1.294.53.7) were performed with Wistar rats weighing 250 ± 30 grams, which were divided into two groups: CLP and Sham operation. After 0, 2, 6 and 24 hours of surgery, CSF was collected for determining the nitrate concentration by the chemiluminescence NO/ozone method. Immediately after, the animals were decapitated, blood was collected and used for hematocrit, serum sodium, protein, interleukin (IL)-1?, nitrate and plasma AVP determination. The neurohypophysis was removed for AVP content determinations and hypothalamus for NOS activity analysis by the method of citrulline. In septic animals, plasma concentrations of AVP showed the expected pattern, an increase at 2h and 6h and returning to basal levels at 24h. The AVP neurohypophyseal stocks decreased at 2h and 6h returning to basal levels at 24h. The sodium serum and plasma proteins decreased 2h, 6h and 24h after CLP, and the hematocrit increased at the same periods. The plasma concentration of IL-1? and nitrate increased 6h and remained elevated 24h after CLP. However, in the cerebrospinal, nitrate increased at 6h but returned to basal level in 24h. The total and constitutive NOS activities were fifty to one hundred times higher than inducible NOS and were increased 6h and 24h after CLP. These results suggest that the activity of NOS observed in the hypothalamus ex vivo of rats septic indicates the presence of viable forms of enzymes, and that the constitutive isoform is the most relevant for the NO production in this brain region. Moreover the temporal alterations of the nitrate concentrations in the CSF differ from the plasma nitrate, showing a different profile of the central and peripheral NO production, which may be related to biphasic AVP secretion in the sepsis.
 
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Publishing Date
2012-11-09
 
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