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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.60.2013.tde-27062013-151724
Document
Author
Full name
Roberto Antonio de Souza
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2013
Supervisor
Committee
Falcão, Juliana Pfrimer (President)
Almeida, Alzira Maria Paiva de
Brocchi, Marcelo
Darini, Ana Lucia da Costa
Hernandes, Rodrigo Tavanelli
Title in Portuguese
Genotipagem de linhagens de Yersinia spp. por high-resolution melting analysis
Keywords in Portuguese
Epidemiologia molecular
Gênero Yersinia
Genotipagem
High-resolution melting analysis
Single-nucleotide polymorphisms
Abstract in Portuguese
O gênero Yersinia pertence à família Enterobacteriaceae e compreende 17 espécies. Y. pestis, Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica são reconhecidamente patógenos de humanos e animais. Y. pestis cause a peste. Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica são agentes causadores, sobretudo, de gastroenterites transmitidas por água e alimentos. As demais 14 espécies são, usualmente, consideradas não-patogênicas, com exceção de Y. ruckeri sorogrupo O:1 que causa infecções em peixes. Nas últimas décadas, a tipagem molecular tornou-se uma importante ferramenta nos estudos filogenéticos de numerosos micro-organismos e o desenvolvimento de sistemas de tipagem rápidos e baratos pode facilitar os estudos epidemiológicos de infecções bacterianas. No presente estudo objetivou-se desenvolver um método de genotipagem de Yersinia spp. baseado em high-resolution melting analysis (HRMA) para diferenciar os single-nucleotide polymorphisms (SNPs) presentes nas sequências dos genes 16S rRNA, glnA, gyrB, hsp60 e recA e aplicá-lo na tipagem de 40 linhagens de Y. pseudotuberculosis e 50 linhagens de Y. enterocolitica, bem como separar por HRMA as espécies Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. Os SNPs foram determinados nas sequências dos loci acima citados a partir de um conjunto de 119 linhagens de Yersinia spp. depositadas no GenBank/EMBL/DDBJ. Foram encontrados nas sequências dos genes analisados de Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. bercovieri, Y. rohdei, Y. intermedia, Y. mollaretii e Y. ruckeri 10, 10, 9, 6, 4, 1 e 1 SNPs, respectivamente. Nenhum SNP foi encontrado nas sequências analisadas de Y. pestis e um grande número de SNPs foi encontrado nas sequências analisadas de Y. frederiksenii, Y. kristensenii e Y. massiliensis, o que impossibilitou a genotipagem dessas espécies por HRMA. As demais espécies não foram analisadas. Foram desenhados pares de primers para flanquear os SNPs encontrados em cada espécie de Yersinia testada. Usando um conjunto de primers espécie-específicos, a diversidade genética de cada espécie de Yersinia foi determinada por HRMA e a análise filogenética foi baseada na sequência concatenada composta pelos nucleotídeos identificados em cada fragmento analisado. O agrupamento foi realizado com o software BioNumerics usando o método UPGMA com 1.000 replicatas de bootstrap. A árvore filogenética ii construída para Y. pseudotuberculosis agrupou as linhagens em clusters bio-sorogrupo específicos. As linhagens do bio-sorogrupo 1/O:1 foram agrupadas em um cluster e as linhagens do bio-sorogrupo 2/O:3 em outro. A árvore filogenética construída para Y. enterocolitica agrupou as linhagens em três grupos. As linhagens altamente patogênicas, do biotipo 1B, foram agrupadas em um cluster, as linhagens de média patogenicidade, dos biotipos 2, 3, 4 e 5, foram agrupadas em um segundo cluster e as linhagens consideradas nãopatogênicas, do biotipo 1A, foram agrupadas em um terceiro cluster. O agrupamento encontrado em Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica foi consistente com o perfil patogênico característico dessas duas espécies. Nenhuma correlação epidemiológica significativa foi encontrada no agrupamento de Y. bercovieri, Y. rohdei, Y. intermedia, Y. mollaretii e Y. ruckeri de acordo com os resultados de HRMA. Ademais, o método de HRMA aqui desenvolvido foi capaz de separar as espécies Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. O método de HRMA desenvolvido nesse estudo pode ser usado como uma alternativa para a genotipagem e para a diferenciação de Y. pseudotuberculosis de Y. enterocolitica. Esse método também pode complementar os métodos baseados em sequências e facilitar os estudos epidemiológicos dessas duas espécies de Yersinia.
Title in English
Genotyping of Yersinia strains by high-resolution melting analysis
Keywords in English
Genotyping
Genus Yersinia
High-resolution melting analysis
Molecular epidemiology
Single-nucleotide polymorphisms
Abstract in English
The genus Yersinia belongs to the family Enterobacteriaceae and comprises 17 species. Y. pestis, Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica are well recognized human and animal pathogens. Y. pestis causes plague. Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica are, usually, causative agents of food-waterborne gastroenteritis. The other 14 Yersinia species are considered to be non-pathogenic, with the exception of Y. ruckeri serogroup O:1 which causes infections in fishes. In the last few decades, molecular typing has become an important tool in phylogenetic studies of several microorganisms and the development of fast and inexpensive typing systems can facilitate epidemiological studies of bacterial infections. The present study aimed to develop a method of Yersinia spp. genotyping based on high-resolution melting analysis (HRMA) in order to differentiate the single-nucleotide polymorphisms (SNPs) present in the 16S rRNA, glnA, gyrB, hsp60 and recA sequences and apply it in the typing of 40 Y. pseudotuberculosis strains and 50 Y. enterocolitica strains, as well as, to separate by HRMA the Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica species. The SNPs were determined in the sequences of the aforementioned loci using a set of 119 Yersinia strains deposited in the GenBank/EMBL/DDBJ database. It were found in the gene sequences analyzed of Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. bercovieri, Y. rohdei, Y. intermedia, Y. mollaretii and Y. ruckeri 10, 10, 9, 6, 4, 1 and 1 SNPs, respectively. No SNPs was found in the analyzed sequences of Y. pestis and a large number of SNPs were found in the analyzed sequences of Y. frederiksenii, Y. kristensenii and Y. massiliensis what prevented their genotyping by HRMA. The remaining Yersinia species were not analyzed. It was designed primer pairs to flank the SNPs found in each Yersinia species tested. Using a specie-specific set of primers, the genetic diversity of each Yersinia species used was determined by HRMA and the phylogenetic analysis was based on the concatenated sequence composed by the nucleotides identified in each fragment analyzed. Clustering was performed with the software package BioNumerics using UPGMA method and 1,000 bootstrap replicates. The phylogenetic tree constructed for Y. pseudotuberculosis grouped the strains into bio-serogroups specific clusters. The strains of 1/O:1 bio-serogroup were grouped into one cluster and the strains of 2/O:3 bio-serogroup into iv other cluster. The phylogenetic tree constructed for Y. enterocolitica grouped the strains in three clusters. The highly pathogenic strains, of biotype 1B, were grouped into one cluster, the moderate pathogenic strains, of biotypes 2, 3, 4 and 5, were grouped into a second cluster and, the non-pathogenic strains, of biotype 1A, were grouped into a third cluster. The clusterization of Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica were consistent with the pathogenic profile characteristic of these two Yersinia species. No significant epidemiological correlation was found in the grouping of Y. bercovieri, Y. rohdei, Y. intermedia Y. mollaretii and Y. ruckeri according to HRMA results. Moreover, the HRMA-based method develop here was able to separate the Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica species. The HRMA assay developed in this study can be used as an alternative for the genotyping and the differentiation of Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica. This method can also complement sequence-based methods and facilitate epidemiological studies of these two Yersinia species.
 
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Publishing Date
2013-07-01
 
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