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Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.60.2013.tde-27112013-095252
Document
Auteur
Nom complet
Fábio Campioni
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2013
Directeur
Jury
Falcão, Juliana Pfrimer (Président)
Darini, Ana Lucia da Costa
Brocchi, Marcelo
Destro, Maria Teresa
Nogueira, Mara Correa Lelles
Titre en portugais
Tipagem molecular e análise da diversidade genética de linhagens de Salmonella Enteritidis isoladas de humanos, alimentos e frangos no Brasil
Mots-clés en portugais
Genes de virulência
Resistência a antimicrobianos
Salmonella Enteritidis
Salmonelose
Tipagem molecular
Resumé en portugais
A doença decorrente da infecção por Salmonella é um dos maiores problemas de saúde no mundo em termos de morbidade e mortalidade. Entre as sorovariedades de Salmonella, a sorovariedade Enteritidis é a de maior ocorrência mundial e compreende linhagens que tem seu nicho biológico relacionado a frangos e ovos. Várias metodologias de tipagem fenotípicas e genotípicas foram desenvolvidas a fim de se delinear a epidemiologia das infecções por S. Enteritidis. Entretanto a tipagem fenotípica usualmente falha em discriminar linhagens relacionadas das nãorelacionadas epidemiologicamente e apresenta problemas de reprodutibilidade que foram minimizados com a utilização de métodos genotípicos. No Brasil, poucos estudos que utilizaram técnicas moleculares na tipagem de linhagens dessa sorovariedade foram realizados. Os objetivos desse estudo foram investigar o potencial patogênico, a resistência a antimicrobianos e realizar a tipagem molecular de linhagens de Salmonella Enteritidis isoladas de humanos, de alimentos e de frangos no Brasil. Para isso foram estudadas 188 linhagens de Salmonella Enteritidis isoladas de surtos e de casos esporádicos, de humanos (67) de alimentos (61) e de frangos (60), durante o período de 1986 a 2010, de vários locais do Brasil. A susceptibilidade frente a 14 antimicrobianos foi analisada através da técnica de disco difusão e a presença de 13 genes de virulência das ilhas de patogenicidade de Salmonella I e II e do plasmídio pSEV foram pesquisados por PCR. Os mecanismos de resistência a quinolonas foram verificados através da pesquisa de genes de resistência plasmidiais e cromossomais e também através da verificação de mutações no gene gyrA por High resolution melting analysis (HRMA) seguida de sequenciamento de algumas linhagens. As linhagens também foram tipadas molecularmente pelas metodologias Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) com a enzima XbaI, Multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) e por Multilocus sequence typing (MLST). Das 188 linhagens estudadas, 42,5% foi resistente ao ácido nalidíxico e somente 0,5% foi resistente a sulfametoxazol-trimetoprima e estreptomicina. A resistência a quinolonas foi relacionada principalmente a mutações no gene gyrA. A maioria das linhagens estudadas (98,4%) apresentou todos os genes de virulência pesquisados, sendo uma linhagem negativa para o gene sipA e duas linhagens negativas para o gene prot6E. ERIC-PCR dividiu as 128 linhagens isoladas de humanos e alimentos em 55 perfis diferentes com similaridade >79,7%. PFGE dividiu essas mesmas linhagens em 68 perfis diferentes com uma similaridade >73,1%. Para as linhagens isoladas de frango, o dendrograma concatenado de ERIC-PCR e PFGE dividiu as 60 linhagens em dois grandes grupos com 73,3% de similaridade. O grupo A consistiu de linhagens isoladas tanto de material clínico de frangos (23) quanto do ambiente da granja (5) com 81,2% de similaridade. O grupo B também consistiu de linhagens isoladas tanto de casos clínicos de frangos (21) quanto do ambiente da granja (11) com 81,1% de similaridade. MLVA dividiu as 188 linhagens isoladas no Brasil e outras 100 linhagens isoladas na América do Norte em dois grandes grupos. O grupo MLVA-A apresentou 71 linhagens isoladas na América do Norte e somente três linhagens isoladas no Brasil. Essas linhagens do ii Brasil incluíram as isoladas antes do início da pandemia de S. Enteritidis se iniciar no país. Em contraste, o grupo MLVA-B agrupou 185 linhagens isoladas no Brasil e 29 linhagens isoladas na América do Norte. As linhagens presentes no grupo A, foram divididas em 34 tipos genéticos diferentes com similaridade maior do que 46%, enquanto no grupo B as linhagens se diferenciaram em 15 tipos genéticos diferentes com mais de 66% de similaridade. MLST caracterizou 44 das 46 linhagens estudadas como pertencentes ao ST 11. As outras duas linhagens apresentaram alelos que não existiam no banco de dados e caracterizaram dois novos STs, o 1632 e o 1633. Os resultados de tipagem molecular obtidos por ERICPCR, PFGE e MLVA no presente estudo, demonstraram uma alta similaridade genotípica entre linhagens de S. Enteritidis isoladas no Brasil, o que sugere que as linhagens estudadas descendem de um precursor comum que pouco se diferenciou genotipicamente ao longo de 24 anos no país. Ademais, os resultados de MLVA sugerem que um novo e prevalente subtipo foi introduzido no Brasil após 1993 e tem contaminado alimentos e infectado humanos e animais. O grande número de genes de virulência encontrados reforça o potencial das mesmas causarem doenças em humanos e animais, bem como, os riscos de sua presença em alimentos. Ademais, a grande porcentagem de linhagens resistentes ao ácido nalidíxico observadas a partir de 1996 sugere o uso de quinolonas no tratamento de infecções em animais causadas por S. Enteritidis no Brasil.
Titre en anglais
Molecular typing and analysis of the genetic diversity of Salmonella Enteritidis strains isolated from humans, food and chickens in Brazil
Mots-clés en anglais
antimicrobial resistance
molecular typing
Salmonella Enteritidis
salmonelose
virulence genes
Resumé en anglais
The disease caused of the infection by Salmonella is one of the major health problem worldwide in terms of morbid and mortality. Among the Salmonella serovars, the Enteritidis is the most frequent isolated one and comprises strains that have their biological niche related to chickens and eggs. Several phenotypic and genotypic methodologies were developed to trace epidemiologically the infections by S. Enteritidis. However, the phenotypic typing usually fail to discriminate related from unrelated epidemiologicaly strains and presents problems of reproducibility that were minimized with the introduction of genotypic methods. In Brazil, few studies that used molecular typing techniques to type strains of this serovar were conducted. The aims of this study were to investigate the pathogenic potential, the antimicrobial resistance and to molecularly type of Salmonella Enteritidis strains isolated from humans, food and chickens in Brazil. For this, it was studied 188 strains of Salmonella Enteritidis isolated from outbreaks and sporadic cases, from humans (67), food (61) and chickens (60), during the period of 1986 to 2010, from various places of Brazil. The susceptibility to 14 antimicrobials were analyzed by the disc diffusion technique and the presence of 13 virulence genes of the Salmonella pathogenicity islands I and II and from the pSEV plasmid were searched by PCR. The mechanisms of resistance to quinolones were verified by the search of plasmidial and cromossomal resistance genes and also by the verification of mutations in the gyrA gene by High resolution melting analysis (HRMA) followed by sequencing of some strains. The strains were also molecularly typed by the methodologies Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using the enzyme XbaI, Multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) and by Multilocus sequence typing (MLST). From the 188 strains studied, 42.5% were resistant to nalidixic acid and only 0.5% were resistant to sulfamethoxazoletrimethoprim and streptomycin. Resistance to quinolones was related mainly to mutations in the gyrA gene. The majority of the strains studied (98.4%) harbored all the virulence genes searched, being only one strain negative for the sipA gene and two strains negative for the prot6E gene. ERIC-PCR divided the 128 strains isolated from humans and food in 55 different profiles with >79.7% of similarity. PFGE divided the same strains in 68 different profiles with a similarity of >73.1%. Regarding the strains isolated from chickens, the concatenated dendrogram of ERIC-PCR and PFGE divided the 60 strains in two major groups with a similarity of 73.3%. Group A consisted of strains isolated either from chicken's clinical samples (23) or from the farm environment (5) with a similarity of 81.2%. Group B also consisted of strains isolated either from chicken's clinical samples (21) or from the environment (11) with a similarity of 81.1%. MLVA divided the 188 strains isolated in Brazil and other 100 strains isolated from North America in two major groups. MLVA-A group consisted of 71 strains isolated in North America and only three strains isolated in Brazil. These strains from Brazil included the ones isolated before the beginning of the pandemic of S. Enteritidis in this country. In contrast, MLVA-B group clustered 185 strains isolated in Brazil and 29 strains isolated in North America. The strains in the MLVA-A group were divided in 34 different genotypic types with a similarity of 46%, while strains in iv the group B were divided in 15 different genotypic types with a similarity of 66%. MLST characterized 44 of the 46 strains studied as belonging to ST 11. The other two strains presented new alleles that characterized two new STs, the 1632 and the 1633. The results of molecular typing obtained by ERIC-PCR, PFGE and MLVA in this study showed a high genotypic similarity among S. Enteritidis strains isolated in Brazil, which suggests that the strains studied descend from a common ancestor that differed little genotypically during 24 years in the country. Moreover, the results of MLVA suggest that a new and prevalent subtype was introduced in Brazil after 1993 and has been contaminating food and infecting humans and animals. The high prevalence of virulence genes found in the strains studied reinforce their potential to cause disease in humans and animals, as well as the risks of their presence in food. Moreover, the high percentage of strains resistant to nalidixic acid observed after 1996 suggests the use of quinolones in the treatment of animal infections by S. Enteritidis in Brazil.
 
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Date de Libération
2017-11-27
Date de Publication
2013-12-19
 
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