• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Disertación de Maestría
DOI
10.11606/D.60.2014.tde-18112014-084221
Documento
Autor
Nombre completo
Natasha Faiani Furtado
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2014
Director
Tribunal
Costa Filho, Antônio José da (Presidente)
Cabral, Hamilton
Oliveira, Arthur Henrique Cavalcante de
Título en portugués
Explorando novas facetas da interação entre a Enzima Clorocatecol 1,2-dioxigenase e seus ligantes
Palabras clave en portugués
Biorremediação
cinética enzimática
Clorocatecol 1,2- dioxigenase
interação com membranas
Pseudomonas putida
Resumen en portugués
O uso intensivo de produtos organoclorados contendo estruturas aromáticas em sua composição tem crescido de forma rápida nos últimos anos em face de sua ampla utilização em vários setores da indústria moderna. A decomposição de tais compostos é lenta, dada sua grande estabilidade química, tornando-os poluentes recorrentes do meio-ambiente. Diferentes estratégias estão disponíveis para tentar solucionar este problema. Os chamados processos de bioremediação estão entre elas e vem ganhando espaço dentre as possíveis escolhas em face de sua maior eficiência e por estarem baseados no uso de moléculas como enzimas, que não afetam o ambiente, para realizar a tarefa de degradação de substâncias tóxicas. Neste contexto se coloca a enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida, alvo de estudos deste trabalho. Nosso grupo tem trabalhado no entendimento do mecanismo de ação da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida há alguns anos já que acreditamos que a utilização de forma mais eficiente e efetiva possível da enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas. putida passa necessariamente pelo conhecimento acerca de maneiras de controle da atividade enzimática. Com isso, os resultados obtidos consistiram na otimização dos processos de expressão e purificação que permitiram a obtenção da proteína pura e com bom rendimento, após mudança no vetor de expressão. Foram feitos ensaios de atividade enzimática com diferentes substratos e desenvolvimento de um protocolo de caracterização cinética, para assim avaliar a existência de mecanismos de inibição/modulação da reação pelo substrato e/ou produto. Análise da estrutura secundária por meio de dicroísmo circular e dicroísmo circular com radiação síncrotron para avaliar a integridade estrutural frente da nova construção. Também foram realizados testes para separação dos ligantes enzima clorocatecol 1,2-dioxigenase de Pseudomonas putida para análise em espectrômetro de massas afim de se identificar as moléculas anfipáticas que podem estar presentes em seu sítio hidrofóbico. Por fim, ensaios de interação proteína-lipídio utilizando calorimetria diferencial de varredura, ressonância paramagnética eletrônica e dicroísmo circular indicam uma provável interação com modelos de membrana, principalmente, quando na presença de PIP2 (fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato).
Título en inglés
Exploring new facets of the interaction between the enzyme chlorocatechol 1,2-dioxygenase and its ligands
Palabras clave en inglés
Bioremediation
chlorocatechol 1,2-dioxygenase enzyme kinetics
interaction with membranes.
Pseudomonas putida
Resumen en inglés
The use of chlorinated compounds bearing aromatic structures in their chemical composition has quickly grown in the last few years due to their general presence in processes of modern industry. The degradation of such compounds is slow, due to their high chemical stability, thus making them frequent polutants of the environment. Different strategies to tackle this problem are available. The so-called bioremediation methods are among those strategies and have been gaining many applications because of their higher efficiency and due to the use of enzymes, which do not affect the environment, to perform the degradation task. Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida is one of those enzymes and is the object of study of this project. Our group has been working on understanding the mechanism of action of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida since we believe that a more efficient use of Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida necessarily involves knowledge about ways of controlling the enzymatic activity. Thus, our results consisted in the optimization of the expression and purification protocols that allow the production of pure protein in high yields after changing its expression vector. Assays of enzyme activity with different substrates and development of a protocol for kinetic characterization was also done to assess the existence of mechanisms of inhibition/modulation of the reaction by the substrate and/or product. Analysis of the secondary structure by circular dichroism and synchrotron radiation circular dichroism was also performed to assess the integrity of the new construction. Tests were also carried out to separate the amphipatic ligands present in the Chlorocatechol 1,2-dioxygenase from Pseudomonas putida structure for analysis in a mass spectrometer in order to identify which kind of amphipathic molecule may be present in enzyme hydrophobic site. Finally, lipid-protein interactions were investigated by means of differential scanning calorimetry, electron paramagnetic resonance and circular dichroism. The results indicated a potential interaction with model membranes, especially in the presence of PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate).
 
ADVERTENCIA - La consulta de este documento queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso:
Este documento es únicamente para usos privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro. Esta reserva de derechos afecta tanto los datos del documento como a sus contenidos. En la utilización o cita de partes del documento es obligado indicar el nombre de la persona autora.
Fecha de Liberación
2016-11-17
Fecha de Publicación
2014-11-26
 
ADVERTENCIA: Aprenda que son los trabajos derivados haciendo clic aquí.
Todos los derechos de la tesis/disertación pertenecen a los autores
Centro de Informática de São Carlos
Biblioteca Digital de Tesis y Disertaciones de la USP. Copyright © 2001-2021. Todos los derechos reservados.