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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2020.tde-19122019-082308
Documento
Autor
Nombre completo
Marília de Lima Cirqueira
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2019
Director
Tribunal
Nonato, Maria Cristina (Presidente)
Uyemura, Sergio Akira
Guimarães, Beatriz Gomes
Oliveira, Arthur Henrique Cavalcante de
Título en portugués
Estudos estruturais da enzima nitrorredutase de Trypanosoma cruzi: caracterização do mecanismo de ativação dos pró-fármacos benznidazol e nifurtimox
Palabras clave en portugués
Doença de chagas
Nitrorredutase
Proteína de membrana
Trypanosoma cruzi
Resumen en portugués
A doença de Chagas é uma antropozoonose causada pelo parasita Trypanosoma cruzi e que afeta aproximadamente 5 milhões de pessoas somente na América Latina, causando, no mundo todo, cerca de 10 mil mortes por ano. A doença de Chagas crônica tem grande impacto social e econômico devido a morbidade relacionada a mesma. O benznidazol é atualmente o único medicamento disponível no Brasil para o tratamento da doença de Chagas. Usado há mais de 40 anos, é caracterizado por baixa efetividade na fase crônica da doença, alta toxicidade e casos de resistência já foram relatados. Estudos demonstraram que os compostos nitroaromáticos, como o benznidazol, são pró-fármacos ativados pela redução do grupo nitro, gerando metabólitos citotóxicos, uma reação que é catalisada pela enzima nitrorredutase do tipo I (TcNTR), ausente no hospedeiro humano. Apesar de inúmeros esforços da comunidade científica, a estrutura tridimensional da TcNTR, assim como as bases moleculares e químicas de ativação seletiva dos pró-fármacos são ainda desconhecidas. Nesse contexto, esse trabalho teve objetivo iniciar os estudos de caracterização da enzima TcNTR, através do uso de uma gama de técnicas biofísicas e bioquímicas. Duas diferentes construções, TcNTR72 e TcNTR78, foram expressas, purificadas e foram avaliadas com relação a estabilidade química e térmica por meio de técnicas de fluorimetria de varredura diferencial (DSF) explorando o grupo prostético endógeno mononucleotídeo de flavina (FMN) como a sonda fluorescente (ThermoFMN), e por espalhamento dinâmico de Luz (DLS). Nossos estudos mostraram que a construção TcNTR72 é mais estável e a presença do detergente triton X-100 é fundamental para a manutenção da integridade estrutural da proteína. Técnicas de calorimetria de varredura diferencial (DSC) e de tensiometria foram cruciais para demonstrar pela primeira vez a interação da TcNTR com membranas modelo que mimetizam a membrana interna mitocondrial. Estudos de modelagem molecular baseado em homologia e por métodos ab initio sugerem que a enzima TcNTR se enovela de forma similar às NTRs de bactéria. Domínios estruturais preditos como essenciais para a dimerização assim como o sítio do FMN localizado na interface dimérica foram identificados como conservados. A maior diferença entre a enzima TcNTR e as proteínas homólogas em bactérias aparece pela inserção de um fragmento de 23 resíduos na TcNTR, predito enovelar na forma de hélice-?. Com base em nossos resultados e nas diferenças em termos de localização celular e função entre as enzimas TcNTR e de bactéria, nossos estudos sugerem que a região pode ser importante para a interação da TcNTR com a membrana interna na mitocôndria do parasita. A alta identidade sequencial compartilhada entre as enzimas de tripanossomatídeos sugerem que nossos achados poderão ser extrapolados para o estudo das NTRs de outros parasitas como Leishmania spp e Trypanossoma brucei
Título en inglés
Structural studies on Trypanosoma cruzi nitroreductase enzyme: characterization of prodrug activation mechanism for benznidazole and nifurtimox
Palabras clave en inglés
Chagas disease
Membrane protein
Nitroreductase
Trypanosoma cruzi
Resumen en inglés
Chagas disease is an anthropozoonosis caused by the parasite Trypanosoma cruzi, affecting approximately 5 million people in Latin America alone, and causing, worldwide, around 10 thousand deaths a year. Chronic Chagas disease have a major social and economic impact due to the disease causing disabilities. Benznidazole is currently the only drug available in Brazil for the treatment of Chagas disease. Used for more than 40 years, it is characterized by low effectiveness in the chronic phase, high toxicity and cases of resistance have been reported. Studies have shown that nitroaromatic compounds, such as benznidazole, are prodrugs activated by the reduction of the nitro group, generating cytotoxic metabolites, a reaction that is catalyzed by nitroreductase type I (TcNTR), absent in the human host. Despite several efforts by the scientific community, the three-dimensional structure of TcNTR, as well as the molecular and chemical bases of prodrugs selective activation are still unknown. In this context, this work aimed at initiating the characterization studies of the enzyme TcNTR, using a range of biophysical and biochemical techniques. Two different constructs, TcNTR72 and TcNTR78, were expressed, purified and evaluated for chemical and thermal stability by differential scanning fluorimetry (DSF), exploring the endogenous prosthetic group of flavin mononucleotide (FMN) as the fluorescent probe (ThermoFMN), and by dynamic light scattering (DLS). Our studies have shown that the TcNTR72 construct is more stable and the presence of the detergent Triton X-100 is critical for maintaining the structural integrity of the protein. Differential scanning calorimetry (DSC) and tensiometry techniques were crucial to demonstrate, for the first time, the interaction of TcNTR with model membranes that mimics the inner mitochondrial membrane. Homology and ab initio molecular modeling suggest that the folding of TcNTR is similar to bacterial NTRs. Structural domains predicted to be essential for dimerization as well as the site of FMN binding located at the dimeric interface were identified as conserved. The major difference between TcNTR enzyme and the homologous bacterial proteins appears to be the insertion of a 23 residues fragment in TcNTR, predicted to fold in the form of an ? helix. Based on our results and the differences in cell localization and function between TcNTR and bacterial enzymes, our studies suggest that the region may be important for the interaction of TcNTR with the parasite inner mitochondrial membrane. The high sequence shared among trypanosomatid NTRs enzymes suggests that our findings can be extrapolated to the study of NTRs from other parasites such as Leishmania spp. and Trypanosoma brucei
 
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Fecha de Liberación
2021-12-18
Fecha de Publicación
2020-02-28
 
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