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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.60.2009.tde-24102009-140328
Documento
Autor
Nome completo
Patrícia Rosa Feliciano
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2009
Orientador
Banca examinadora
Costa, Maria Cristina Nonato (Presidente)
Oliveira, Arthur Henrique Cavalcante de
Thiemann, Otavio Henrique
Título em português
Clonagem, expressão heteróloga e caracterização do gene LmjF24.0320 que codifica a enzima fumarato hidratase em Leishmania major
Palavras-chave em português
Leishmania major
Cinética enzimática
Clonagem
Expressão
Fumarato hidratase
Localização celular
Purificação
Resumo em português
Leishmania é um protozoário parasito flagelado responsável pela Leishmaniose, doença que afeta 88 países, distribuídos em 4 continentes, e que causa um risco a aproximadamente 350 milhões de pessoas. Estudos recentes em tripanosomatídeos, utilizando Trypanosoma brucei como modelo, sugerem que as enzimas fumarato hidratase, enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato, são essenciais para sobrevivência de tripanossomatídeos. O presente projeto visou a clonagem, expressão, purificação e caracterização cinética e biofísica da enzima fumarato hidratase codificada pelo gene LmjF24.0320 de Leishmania major. A proteína foi expressa em bactéria e purificada por cromatografia de afinidade. Os ensaios de cinética enzimática mostram que a enzima segue o modelo de cinética de Michaelis-Menten com Km e Vmax de 2,7 ± 0,5 mM e 35,2 ± 5,8 micromol/min/mg para fumarato e 5,2 ± 0,4 mM e 11,8 ± 0,6 micromol/min/mg para S-malato, respectivamente. Para os estudos de localização celular foram produzidos e purificados anticorpos policlonais para as isoformas LmFH-1 e LmFH-2 de Leishmania major através de imunização de coelhos. A combinação de técnicas de imunofluorescência por microscopia confocal, western blotting e controle da atividade enzimática através fracionamento celular com digitonina nos permitiu concluir que a isoforma LmFH-1 se encontra localizada na mitocôndria do parasito, enquanto que a isoforma LmFH-2 possue dupla localização, sendo encontrada tanto no citosol quanto no glicossomo. A presença das isoformas LmFH-1 e LmFH-2 nos três compartimentos celulares: citosol, glicossomo e mitocôndria reforçam a importância da molécula de fumarato em diferentes processos celulares, e fortalecem a idéia de que a enzima fumarato hidratase pode ser considerada um potencial alvo para planejamento de fármacos anti-leishmaniose.
Título em inglês
Cloning, heterologous expression and characterization of the gene LmjF24.0320 that encodes the enzyme fumarate hydratase in Leishmania major.
Palavras-chave em inglês
Leishmania major
Cellular localization
Cloning
Expression
Fumarate hydratase
Kinetic
Purification
Resumo em inglês
Leishmania parasites are the casual agent of leishamaniasis, a group of disease that affects 88 countries, distributed in four continents, with 350 million people at risk of infection. Recent studies in trypanosomatids, using Trypanosoma brucei as a model suggest that the fumarate hydratase enzymes, which catalyze the stereospecific hydration of fumatare to malate, are essential for trypanosomatid survival. The present project focused the cloning, expression, purification and both kinetic and biophysical characterization of fumarate hydratase encoded by gene LmjF24.0320 of Leishmania major. The protein has been expressed in bacteria and purified by affinity chromatography. The kinetic experiments reveal that the enzyme follow the Michaelis-Menten classic model with Km and Vmax of 2,7 ± 0,5 mM and 35,2 ± 5,8 micromol/min/mg for fumarate and 5,2 ± 0,4 mM and 11,8 ± 0,6 micromol/min/mg for S-malate, respectively. For the subcellular localization studies, polyclonal antisera against both isoforms LmFH-1 e LmFH-2 of Leishmania major were obtained after immunization of rabbits. The combination of confocal microscopy, western blotting and enzymatic activity through cell fractionation by selective permeabilization of membranes with digitonin suggest that LmFH-1 isoform is localized to mitochondria, while the LmFH-2 isoform is found to both cytosol and glycossome. The presence of LmFH-1 and LmFH-2 isoforms at the three cell compartments: cytosol, glycosome and mitochondria strongly supports the premise that fumarate is important for many cell processes and suggests that fumarate hydratase enzyme can be considered an attractive target for the development of anti-leishmaniasis drugs.
 
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Data de Publicação
2010-04-13
 
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