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Thèse de Doctorat
DOI
Document
Auteur
Nom complet
Camila Cubayachi
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2019
Directeur
Jury
Lopez, Renata Fonseca Vianna (Président)
Beppu, Marisa Masumi
Chorilli, Marlus
Paula, Jayter Silva de
Vicentini, Fabiana Testa Moura de Carvalho
Titre en portugais
Avaliação de formulações a base de fibroína da seda e insulina no tratamento tópico de feridas oculares
Mots-clés en portugais
Cicatrização da córnea
Fibroína da seda. Insulina
Filme
Sistema de liberação ocular
Resumé en portugais
O processo de cicatrização das feridas na córnea em pacientes com doenças crônicas, como a diabetes mellitus, é deficiente, o que pode acarretar em erosões recorrentes, opacidade e até mesmo cegueira, e usualmente não responde aos tratamentos convencionais. Estudos demonstraram o potencial da insulina (INS) na cicatrização de feridas epiteliais da córnea, mas sua administração tópica requer o uso de sistemas carreadores para garantir sua estabilidade e liberação controlada no sítio a ser regenerado. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver filmes a base de fibroína da seda (FS) contendo INS e avaliar seu potencial no tratamento tópico de feridas oculares. Os filmes de FS contendo INS na concentração de 100 UI/cm2 e glicerina como plastificante foram obtidos por evaporação de solvente e apresentaram-se homogêneos, transparentes, permeáveis ao vapor de água, com baixa capacidade de intumescimento e elevada resistência mecânica. Análises de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier e calorimetria diferencial exploratória sugeriram conformação da INS em folhas-?/Seda II, além de ocorrência de interações não-covalentes entre INS e FS, capazes de estabilizar a estrutura do filme. Um método analítico para quantificar a INS por cromatografia líquida de alta eficiência foi desenvolvido e validado, apresentando-se seletivo, preciso, exato e linear no intervalo de 3 a 100 ?g/mL. Estudos de liberação in vitro demonstraram que os filmes foram capazes de liberar cerca de 8% da INS nos primeiros 30 minutos, atingindo 22% em 12 horas, totalizando 1 UI (3,5 ?g), sem liberação adicional até 24 horas. Entretanto, estudos de degradação enzimática permitem sugerir que as proteinases presentes nas feridas seriam capazes de ocasionar quebras no filme quando aplicado, o que apresentaria um componente adicional na liberação da INS. O espectro de dicroísmo circular de amostras do receptor demonstrou que a insulina liberada dos filmes manteve sua conformação nativa, além de conservar atividade biológica in vivo, reduzindo a glicemia sanguínea de ratos Wistar. Estudos in vitro em cultura de células epiteliais da córnea humana (HCEC-SV40) demonstraram que o tratamento com os filmes não ocasionou citotoxicidade. Ainda, em modelo inflamatório estabelecido através do estímulo das células com lipopolissacarídeo de E. coli, observou-se que os filmes foram capazes de modular os níveis de mediadores do processo inflamatório, como interleucina 6 e metaloproteinase de matriz 9. Finalmente, estudos de cicatrização in vivo utilizando modelo de debridamento do epitélio da córnea de ratos Wistar diabéticos permitiram avaliar a capacidade da INS liberada dos filmes em modular o processo inflamatório e permitir a regeneração do epitélio corneano, favorecendo as características fenotípicas das células epiteliais. Desta forma, os filmes de FS demonstraram ser um sistema de liberação de INS promissor para a administração tópica ocular e tratamento da cicatrização de feridas epiteliais da córnea.
Titre en anglais
Evaluation of formulations based on silk fibroin and insulin in the topical treatment of ocular wounds
Mots-clés en anglais
Corneal wound healing
Film
Insulin
Ocular drug delivery system.
Silk fibroin
Resumé en anglais
The corneal wound healing process in patients suffering of chronic diseases, like diabetes mellitus, is impaired, which can lead to recurrent erosions, opacity and even blindness, and usually does not respond to conventional treatments. Studies have demonstrated the potential use of insulin (INS) in wound healing, however its topical administration requires the use of delivery systems to ensure its stability and controlled release on the area to be regenerated. Thus, the objective of this work was to develop films based on silk fibroin (SF) containing INS and evaluate their potential on the topical treatment of ocular wounds. The SF films containing INS at 100 IU/cm2 and glycerin as plasticizer were obtained by casting. They were homogeneous, transparent, permeable to water vapor, with low swelling index and high mechanical resistance. Fourier transformed infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry analyses suggested the ?-sheet/Silk II conformation of SF, besides the occurrence of non-covalent interactions between INS and SF, capable to promote the stabilization of film structure. An analytical method based on high performance liquid chromatograph was developed and validated, presenting selectivity, precision, accuracy and linearity in the range of 3 to 100 ?g/mL. In vitro drug release studies have demonstrated that the films were capable of releasing about 8% of INS in the first 30 minutes, reaching 22% in 12 hours, totaling 1 IU (3.5 ?g), without further release up to 24 hours. However, enzymatic degradation studies suggested that the proteinases present in the wounds would be capable of causing breaks in the film when applied, which could be an additional component in the INS release. The circular dichroism spectrum of the receptor solution samples demonstrated that the INS released from the films maintained their native conformation, in addition to conserving its biological activity in vivo, reducing the blood glycemia of Wistar rats. In vitro studies with human epithelial cornea cells (HCEC-SV40) showed that the treatment with the films were not cytotoxic. Furthermore, in an inflammatory model established by the cell stimulation with E. coli lipopolysaccharide, it was observed that the films were able to modulate the levels of inflammatory mediators of wound healing process, such as interleukin-6 and matrix metalloproteinase-9. Finally, in vivo wound healing studies using corneal epithelial debridement model of diabetic Wistar rats allowed the evaluation of INS release from the films to modulate the inflammatory process and regenerate the corneal epithelia, favoring the phenotypic characteristics of the epithelial cells. Therefore, SF films have been shown to be a promising INS delivery system for topical ocular administration and healing of corneal epithelial wounds.
 
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Date de Libération
2021-09-03
Date de Publication
2019-11-18
 
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