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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.60.2012.tde-21052012-102006
Documento
Autor
Nome completo
Thiago Barth
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2012
Orientador
Banca examinadora
Bonato, Pierina Sueli (Presidente)
Bastos, Jairo Kenupp
Guimaraes, Luiz Fernando Lopes
Queiroz, Maria Eliana Lopes Ribeiro de
Steppe, Martin
Título em português
Análise estereosseletiva de bufuralol, donepezila, midodrina e seus metabólitos e aplicações em estudos de biotransformações com fungos
Palavras-chave em português
Análise estereosseletiva
Biotransformação
Bufuralol
Donepezila
Fungos
Midodrina
Resumo em português
O uso de fungos na biotransformação estereosseletiva de fármacos pode constituirse em uma excelente alternativa à síntese assimétrica para obtenção de metabólitos, bem como aos estudos de biotransformação in vivo e in vitro convencionais. Neste trabalho foram empregados fungos isolados de órgãos internos de plantas, classificados como endofíticos, fungos fitopatógenos, bem como, fungos adquiridos de coleções de micro-organismos. Esses fungos foram empregados no estudo da biotransformação estereosseletiva dos fármacos midodrina, bufuralol e donepezila. Estes fármacos foram selecionados por produzirem metabólitos ativos nos processos de biotransformação em humanos. Para o monitoramento da formação dos metabólitos dos fármacos foi necessário desenvolver e validar métodos analíticos com características adequadas para essa aplicação. Para determinação enantiosseletiva da midodrina e seu metabólito empregou-se a eletroforese capilar, enquanto que para a determinação aquiral empregou-se a cromatografia líquida de alta eficiência. Para avaliar a biotransformação estereosseletiva do bufuralol e donepezila foram desenvolvidos métodos empregando a cromatografia líquida de alta eficiência. Os dados referentes ao estudo de cada fármaco são apresentados em quatro capítulos. O primeiro capítulo apresenta os resultados obtidos no desenvolvimento de um método empregando a eletroforese capilar para a determinação enantiosseletiva de midodrina e seu metabólito desglimidodrina (DMAE) em meio de cultura Czapek. As análises foram realizadas em capilar de sílica de 50 ?m de diâmetro interno e com comprimento efetivo de 40 cm, utilizando 30 mmol L-1 de trimetil- -ciclodextrina dissolvida em solução de acetato de sódio 70 mmol L-1, pH 5, como tampão de análise. A técnica de preparação das amostras empregada foi a extração líquidolíquido. O método foi validado, mostrando linearidade na faixa de concentração de 100 - 12000 ng mL-1, com coeficientes de correlação linear 0.9975. Os resultados de precisão e exatidão foram inferiores a 15% e a robustez do método foi avaliada através de um planejamento fatorial fracionário. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação usando fungos endofíticos. Foram avaliados oito fungos com destaque para o fungo Papulaspora immersa Hotson (SS13) que biotransformou 21,3% da (+)-midodrina em (+)-DMAE e 2,4% da (-)-midodrina em (-)-DMAE, em 72 h de biotransformação, apresentando um excesso enantiomérico de 79,7%. O segundo capítulo apresenta os resultados obtidos no desenvolvimento de um método cromatográfico para a determinação de midodrina e DMAE em meio de cultura Czapek-Dox. As análises foram realizadas no modo reverso de eluição empregando uma coluna Lichrospher 100 RP 18 e fase móvel composta por acetonitrila:ácido fórmico 40 mmol L-1 (60:40, v/v), vazão de 1,4 mL min-1 e detecção em 290 nm. O preparo de amostras empregado foi a extração líquido-líquido, usando acetato de etila como solvente extrator. O método foi validado na faixa de concentração de 0,4 a 40 ?g mL-1, com coeficientes de correlação linear superiores ii a 0,9997. Este método foi aplicado em um estudo de biotransformação da midodrina empregando o fungo endofítico Papulaspora immersa e duas linhagens do fitopatógeno Botrytis cinerea (UCA 992 e 2100). Entre os fungos estudados, o Botrytis cinerea 2100, em condição de agitação, apresentou o maior percentual de biotransformação da midodrina em DMAE (42,2% em 48 h). Além disso, nos cromatogramas referentes a biotransformação em condição estática, pelos fungos Papulaspora immersa e Botrytis cinerea 2100, foi observada a presença de picos adicionais não observados nos controles realizados. Estes fungos foram submetidos à biotransformação em escala ampliada, em condição estática, a partir das quais foram isolados DMAE de ambos os fungos e um derivado desaminado da midodrina (Botrytis cinerea 2100). No terceiro capítulo são apresentados os resultados obtidos com o desenvolvimento de um método para a determinação estereosseletiva do bufuralol e seus metabólitos 1'-oxobufuralol e 1'-hidroxibufuralol em meio Czapek, usando a coluna Chiralcel OD-H no modo normal de eluição. As demais condições cromatográficas empregadas foram: fase móvel constituída por hexano:isopropanol:metanol (97,5:2,0:0,5; v/v/v) acrescidos de 0,5% de dietilamina, vazão 1,5 mL min-1 e detecção no UV em 248 e 273 nm. A microextração em fase líquida com membrana cilíndrica oca em três fases foi usada como procedimento de preparação das amostras. As condições empregadas na extração foram: fase doadora em pH 13 ajustado com NaOH 2 mol L-1, n-octanol como solvente orgânico, fase aceptora constituída por ácido acético 0,2 mol L-1, tempo de extração de 30 min e velocidade de agitação de 1750 rpm. Os valores de recuperação do método ficaram na faixa de 50 - 69%. O método foi aplicado em um estudo piloto de biotransformação com cinco espécies de fungos endofíticos. Nenhum dos fungos estudados biotransformou o bufuralol em 1'-oxobufuralol e/ou 1'-hidroxibufuralol e, devido a isso, o método desenvolvido não foi validado. O quarto capítulo mostra os resultados obtidos com o desenvolvimento de um método empregando a cromatografia líquida de alta eficiência na determinação enantiosseletiva da donepezila, 5-O-desmetil donepezila e 6-O-desmetil donepezila em meio de cultura Czapek. As análises foram realizadas na coluna Chiralpak AD-H no modo normal de eluição. As demais condições cromatográficas empregadas foram: fase móvel constituída por hexano:etanol:metanol (75:20:5, v/v/v) acrescido de 0,3% de trietilamina, vazão 1,5 mL min-1 e detecção no UV em 270 nm. A técnica de preparação das amostras foi a extração líquido-líquido e o solvente extrator foi o acetato de etila. O método descrito foi validado, mostrando linearidade na faixa de concentração de 100 - 10000 ng mL-1 para os enantiômeros da donepezila (r 0,9985) e 100 - 5000 ng mL-1 para os enantiômeros da 5-O-desmetil donepezila e 6- O-desmetil donepezila (r 0,9951). Os valores de recuperação foram superiores a 90% para todos os analitos. O método foi aplicado em um estudo de biotransformação usando fungos. Foram avaliados cinco fungos endofíticos e os fungos Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Beauveria bassiana ATCC 7159. Os fungos endofíticos não desmetilaram a donepezila nas condições estudadas, entretanto, esta reação foi catalisada pelo fungo B. bassiana que biotransformou predominantemente 8,3% da donepezila em (-)-(R)-5-O-desmetil donepezila (ee, 60,6%), enquanto que o fungo C. elegans apresentou biotransformação enantiosseletiva da donepezila em (-)-(R)-6-O-desmetil donepezila (ee, 100%) com um rendimento de 15,1%. Os dados aqui apresentados demonstram que biotransformações com fungos são uma importante alternativa para mimetizar a biotransformação em mamíferos e para a obtenção de metabólitos de fármacos, especialmente na forma de enantiômeros puros.
Título em inglês
Stereoselective analysis of bufuralol, donepezil, midodrine and its metabolites and applications in biotransformations studies with fungi
Palavras-chave em inglês
Biotransformation
Bufuralol
Donepezil
Fungi
Midodrine
Stereoselecive analysis
Resumo em inglês
Drug biotransformations using fungi are considered an alternative approach to the asymmetric synthesis and conventional in vivo and in vitro metabolism studies. In this work, endophytic fungi isolated from health internal plant organs, phythophatogenic fungi and fungi purchased from ATCC were used to study the stereoselective biotransformation of midodrine, bufuralol and donepezil drugs. These drugs were selected because the biotrasformation process in humans results in active metabolites. To evaluate the metabolite formation during the biotransformation study, suitable analytical methods were required. The midodrine biotransformation was evaluated under chiral and achiral conditions. For the enantiosselective determination of midodrine, a capillary electrophoresis method was used, whereas the achiral determination of this drug and its metabolite was carried out by liquid chromatography. The determination of the other drugs was performed by chiral liquid chromatography.The results of each studied drug are presented in four chapters. In the first chapter, a capillary electrophoresis method was described for the stereoselective determination of midodrine and desglymidodrine (DMAE) in Czapek culture medium to be applied to a stereoselective biotransformation study employing endophytic fungi. The electrophoretic analyses were performed using an uncoated fused-silica capillary and 70 mmol L-1 sodium acetate buffer solution (pH 5.0) containing 30 mmol L-1 heptakis (2, 3, 6-tri-O-methyl)--CD as running electrolyte. The applied voltage and temperature used were 15 kV and 15°C, respectively. The UV detector was set at 200 nm. The sample preparation was carried out by liquid- liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 100 -12000 ng mL-1 for each enantiomer of midodrine and DMAE (r 0.9975). Within-day and between-day precision and accuracy evaluated by RSDs and relative errors, respectively, were lower than 15% for all analytes. The method proved to be robust by a fractional factorial design evaluation. The validated method was used to assess the midodrine biotransformation to DMAE by eight endophytic fungi. The fungus Papulaspora immersa (SS13) showed the best biotransformation results. It biotransformed 21.3% of (+)-midodrine to (+)-DMAE and 2.4% of (-)-midodrine to (-)-DMAE, after 72 hours. The observed enantiomeric excess was 79.7%. The second chapter describes the optimization and validation of a method for the determination of midodrine and DMAE in Czapek-Dox culture medium. The analyses were carried out under reverse elution mode using a Lichrospher 100 RP 18 column and acetonitrile: formic acid solution 40 mmol L-1 (60:40, v/v), as mobile phase, at a flow rate of 1.4 mL min-1 and UV detection at 290 nm. The sample preparation was carried out by liquid-liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 0.4 - 40 ?g mL-1 for each analyte (r 0.9997). This method was applied to evaluate the biotransformation of midodrine by the endophyte Papulaspora immersa and two Botrytis cinerea strains (UCA 992 and 2100). Among the studied fungi, Botrytis v cinerea 2100, at shaken condition, showed the higher percentual of DMAE formation (42.2%, at 48 hours). Moreover, the chromatograms obtained for the biotransformation under static condition, showed additional peaks not detected at performed controls, for both Papulaspora immersa and Botrytis cinerea 2100. Further biotransformation experiments were carried out at large scale on static condition. In addition to DMAE, a deaminated midodrine derivative was isolated from Botrytis cinerea 2100. In the third chapter, a three-phase hollow-fiber liquid-phase microextraction (HF-LPME) method was used for the sample preparation of bufuralol and its metabolites 1'-oxobufuralol and 1'- hydroxybufuralol in Czapek culture medium. The analysis was carried out by chiral liquid chromatography using a Chiralcel OD-H column with hexane: isopropanol:methanol (97.5:2.0:0.5, v/v/v) plus 0.5% diethylamine as the mobile phase, and UV detection at 248 and 273 nm. The HF-LPME optimized conditions involved the use of n-octanol as the organic solvent, 0.2 mol L-1 acetic acid as the acceptor phase, donor phase pH adjusted to 13, sample agitation at 1750 rpm and extraction for 30 min. By using this extraction procedure, the recovery rates were in the range of 50-69%. The method was used to assess the biotransformation of bufuralol using five endophytic fungi strains. None of the studied fungi biotransformed bufuralol to 1'-oxobufuralol and / or 1'- hidroxybufuralol and because of this, the method developed was not validated. In the fourth chapter a chiral liquid chromatography method was described for the stereoselective determination of donepezil, 5-O-desmethyl donepezil, and 6-Odesmethyl donepezil in Czapek culture medium to be applied to a stereoselective biotransformation study employing fungi. The analysis was carried out using a Chiralpak AD-H column with hexane:ethanol:methanol (75:20:5, v/v/v) plus 0.3% triethylamine as the mobile phase at a flow rate of 1.5 mL min-1 and UV detection at 270 nm. The sample preparation was carried out by liquid-liquid extraction using ethyl acetate as extractor solvent. The method was linear over the concentration range of 100 -10000 ng mL-1 for each enantiomer of donepezil (r 0.9985) and of 100 - 5000 ng mL-1 for each enantiomer of 5-O-desmethyl donepezil and 6-Odesmethyl donepezil (r 0.9951). Within-day and between-day precision and accuracy evaluated by RSDs and relative errors, respectively, were lower than 15% for all analytes. The recoveries were higher that 90% for all analytes. The validated method was used to assess the donepezil biotransformation by five endophytes and by Cunninghamella elegans ATCC 10028B e Beauveria bassiana ATCC 7159 fungi. The endophytic fungi do not demethylate donepezil at the studied conditions. On the other hand, Beauveria bassiana ATCC 7159 biotransformed 8.3% of donepezil to (-)- (R)-5-O-desmethyl donepezil (ee, 60.6%), while Cunninghamella elegans ATCC 10028B biotransformed 15.1% of donepezil to (-)-(R)-6-O-desmethyl donepezil (ee, 100%). The data presented here show that the biotransformations with fungi are an important alternative to mimetize biotransformations in mammals and to obtain drug metabolites, especially as pure enantiomers.
 
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Data de Publicação
2012-08-03
 
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  • BARTH, Thiago, et al. Chiral HPLC analysis of donepezil, 5-O-desmethyl donepezil and 6-O-desmethyl donepezil in culture medium : application to fungal biotransformation studies [doi:10.1007/s00216-012-6107-3]. Analytical and Bioanalytical Chemistry [online], 2012, vol. 404, n. 1, p. 257-266.
  • BARTH, Thiago, et al. Stereoselective determination of midodrine and desglymidodrine in culture medium : Application to a biotransformation study employing endophytic fungi [doi:10.1002/elps.200900685]. ELECTROPHORESIS [online], 2010, p. NA.
  • BARTH, Thiago, et al. Stereoselective liquid chromatographic determination of 1′-oxobufuralol and 1′-hydroxybufuralol in rat liver microsomal fraction using hollow-fiber liquid-phase microextraction for sample preparation [doi:10.1002/jssc.201100464]. Journal of Separation Science [online], 2011, vol. 34, n. 24, p. 3578-3586.
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