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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2020.tde-22052019-143211
Documento
Autor
Nome completo
Bruna Juliana Moreira Dias
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2018
Orientador
Banca examinadora
Gaitani, Cristiane Masetto de (Presidente)
Calixto, Leandro Augusto
Bogusz Junior, Stanislau
Cardoso, Carmen Lúcia
Nassur, Maria Eugenia Queiroz
Título em português
Desenvolvimento e validação de técnicas de microextração para análise do fluconazol em fluidos biológicos
Palavras-chave em português
Fluconazol
Líquor
Microextração em fase líquida com fibra oca mediada por carreador
Microextração líquido-líquido dispersiva
Plasma
Resumo em português
O fluconazol (FLU) é um antifúngico de amplo espectro de ação desenvolvido na década de 80. Sua análise em amostras biológicas já foi descrita utilizando várias técnicas de preparo como a extração líquido-líquido, em fase sólida, a ultrafiltração e a precipitação de proteínas. No entanto, estas extrações requerem trabalho laboratorial intenso e, muitas vezes, o uso de grandes volumes de solventes orgânicos. Assim, o objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de métodos para a quantificação do fluconazol em amostras de líquor utilizando a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) e em amostras de plasma utilizando a microextração em fase líquida com fibra oca (HF-LPME). Para a definição das condições de extração do FLU foram utilizados delineamentos fatoriais fracionados e delineamentos compostos centrais. A condição estabelecida para extração por DLLME utilizou apenas 200 ?L de líquor e clorofórmio e isopropanol como solvente extrator e dispersor, respectivamente. Para a HF-LPME a condição de extração selecionada fez uso de 500 ?L de plasma, sendo a precipitação de proteínas realizada com Na2SO4. A fibra de polipropileno de 13 cm foi impregnada com solução de octanol:Adogen® 464 (90:10, v/v), a fase aceptora foi composta por NaCl 1 mol.L-1 e várias amostras foram extraídas simultaneamente. Para a análise nos dois métodos foi utilizada a cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos, sendo a fase móvel composta por etanol e água. A validação dos métodos procedeu-se de acordo com os guias da ANVISA e EMA e foi obtida faixa linear de análise de 0,25 a 62,5 ?g.mL-1, recuperação de 70 % para o FLU e de 81 % para a fenacetina por DLLME e o intervalo linear de 1,0 a 62,5 ?g.mL-1, com recuperação de 12 % para o FLU por HF-LPME mediada por carreador. Os valores de precisão e exatidão permaneceram dentro dos limites recomendados, as amostras mantiveram-se estáveis e os métodos foram seletivos e não apresentaram efeito residual, sendo aplicados para determinação da concentração do FLU em amostras de um paciente em tratamento para neuromicose utilizando o fármaco estudado. Portanto, os métodos desenvolvidos utilizaram baixos volumes de solventes e de amostra, apresentaram faixa linear ampla, que permite a análise de amostras de pacientes que fazem uso de diferentes esquemas terapêuticos e, até o momento, são os únicos métodos descritos que fizeram uso de técnicas de microextração para a análise do FLU em amostras biológicas
Título em inglês
Development and validation of liquid microextraction techniques for fluconazole analysis in biological fluids
Palavras-chave em inglês
Carrier mediated hollow fiber liquid phase microextraction
Cerebrospinal fluid
Dispersive liquid-liquid microextraction
Fluconazole
Plasma
Resumo em inglês
Fluconazole (FLU) is a broad-spectrum antifungal agent developed in the 80's, which analysis in biological samples has already been described using several sample preparation techniques such as liquid-liquid extraction, solid-phase extraction, ultrafiltration and protein precipitation. These extractions require intensive work and sometimes the use of large amounts of organic solvents, thus, the aim of this study was the development of two methods for FLU quantification in cerebrospinal fluid (CSF) samples by dispersive liquid-liquid microextraction (DLLME) and in plasma by using hollow fiber liquid phase microextraction (HF-LPME). For extraction optimization, fractional factorial designs and central composite designs were employed. The condition established for DLLME used 200 ?L of CSF and chloroform and isopropyl alcohol as extraction and disperser solvents. For HF-LPME method the extraction was performed with 500 ?L of plasma and protein precipitation with Na2SO4. Also, a 13 cm polypropylene fiber impregnated with octanol: Adogen® 464 (90:10, v/v) and an acceptor phase consisting of NaCl 1 mol L -1 were used and several samples were extracted simultaneously. Quantification for both methods was performed using high performance liquid chromatography with diode array detector and the mobile phase was composed of ethanol and water. The validation was performed according to ANVISA and EMA guidelines and for DLLME method a recovery of 70% for FLU and 81% for phenacetin and a linear range from 0.25 to 62.5 ?g.mL-1 were obtained. For carrier mediated HF-LPME method a range from 1.0 to 62.5 ?g.mL-1 and a recovery of 12% for FLU were achieved. The precision and accuracy values were within the recommended limits, samples kept stable and the developed methods were selective, had no residual effect and were applied to determine the FLU concentration in samples of a patient treated for neuromycosis. Therefore, the developed methods used low solvent and sample volumes and showed wide linear range, which allows the analysis of samples from patientes that make use of different therapeutic schemes and, so far, are the only ones described in literature that are based on microextraction techniques for FLU analysis in biological samples.
 
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Data de Liberação
2021-05-21
Data de Publicação
2020-01-07
 
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