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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.60.2008.tde-31072009-172410
Document
Author
Full name
Viviane Cristina Gumiero
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2008
Supervisor
Committee
Rechia, Carem Gledes Vargas (President)
Debonsi, Hosana Maria
Lourenço, Miriam Verginia
Title in Portuguese
Estudo do efeito do extrato de nim (Azadirachta indica) em cultura de células de Rubus fruticosus.
Keywords in Portuguese
Azadirachta indica
Cultura de células
Elicitor
Espécies reativas de oxigênio
Nim
Respostas de hipersensibilidade
Rubus fruticosus
Abstract in Portuguese
O nim (Azadirachta indica) é conhecido na Ásia devido a várias propriedades biológicas conhecidas desde a antigüidade. Os estudos referentes à ação inseticida dessa planta restringem-se a análise de seus mecanismos de ação sobre insetos e também de seus efeitos sobre trabalhadores rurais que fazem uso de produtos a base de nim; não havendo, na literatura pesquisada, trabalhos relativos aos impactos causados sobre o sistema vegetal. As plantas, assim como outros organismos, possuem a capacidade de se defenderem contra ataque de patógenos. Uma das respostas desencadeadas pelo reconhecimento do patógeno pelas células vegetais é a reação de hipersensibilidade (RH), que envolve a morte imediata das células do sítio primário de infecção, oferecendo resistência ao crescimento do patógeno. A RH é caracterizada pela necrose dos tecidos onde primeiro se manifestou a infecção, e este processo de morte celular programada envolve uma série de sinais que ainda não estão completamente elucidados. Neste trabalho, foram estabelecidas as condições do meio de cultura de células de Rubus fruticosus para os estudos com extrato de sementes de nim, avaliado o efeito elicitor deste sobre a cultura. Foram obtidos extratos hidroalcoólicos E1 e E2 e suas respectivas frações lioflizadas, L1 e L2. Estes extratos apresentaram maior teor de açúcares e lipídeos em sua composição e revelaram potencial antioxidante. Detectou-se a presença de AZA-A em L1 e L2, por meio de CLAE, cujos teores foram de 5,03 e 1,1 mg/mL, respectivamente, com tempo de retenção em torno de 9,5 minutos, confirmado por meio de análises via espectrometria de massas. O extrato L2 foi fracionado nas frações L2 inicial e AZA2. O extrato L2, nas concentrações de 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/mL, e destas frações AZA2 e L2 inicial nas proporções do extrato L2 nestas concentrações, elicitaram células de Rubus fruticosus. O extrato L2, nas concentrações de 0,1; 0,5; 1 e 5 mg/mL, e suas frações AZA2 e L2 inicial nas proporções do extrato L2 nestas concentrações, elicitaram células de Rubus fruticosus. As células de Rubus fruticosus (1,8g) foram incubadas em tampão citrato de sódio contendo o extrato L2 e as frações L2 inicial e AZA2, separadamente, até a concentração de 5 mg/mL, por 1h, em temperatura ambiente. Após este período, os compostos fenólicos, proteínas e açúcares redutores foram determinados no meio extracelular e intracelular por métodos colorimétricos. O efeito destas frações e do extrato L2, na produção de EROs em células intactas de Rubus fruticosus, foi analisado usando a sonda diacetato 2,7-diclorofluoresceína (LEE et al., 1999; MURATA et al., 2001). Os resultados obtidos indicam que AZA isolada não teve efeito sobre respostas de defesa. A fração L2 inicial teve aumento de fenólicos intracelulares, de açúcares redutores extracelulares e diminuição de EROs, com o aumento da concentração do elicitor, indicando potencial antioxidante e mecanismo de defesa. O extrato L2 também demonstrou potencial antioxidante e protetor das células com o aumento da concentração do elicitor, além de possuir ação inseticida.
Title in English
Study of the effects of neem (Azadirachta indica) extract in Rubus fruticosus cell culture.
Keywords in English
Azadirachta indica
Cell culture
Elicitors
Hypersensitivity responses
Neem
Reactive oxygen species
Rubus fruticosus
Abstract in English
The neem (Azadirachta indica) is known in Asia due to their several biological properties. The studies on the insecticide action of neem extracts have only been restrict to the insect mechanisms and their effects on rural workers; studies on the impact in the vegetable system are not available. The plants, like the other organisms, have the ability to self-defend against attack of patogens. The hypersensitive response (RH), a type of programmed cell death (PCD) in plants, is triggered by plant cells when they recognize the patogen, and is characterized by necrosis of tissues in the local region surrounding the infection; the signals involved are still not completely elucidated. The present study evaluated the effects of neem extracts in Rubus fruticosus cell. The powdered seeds were submitted to two consecutive extractions with ethanol:water (1:1, v/v) at room temperature for 10 minutes, yielding E1 and E2 fractions. The solvent was evaporated and the aqueous extracts were concentrated and lyophilized, resulting in two samples, L1 and L2. They are used for analyses by high performance liquid chromatograph (HPLC) in C-18 column (4.6 x 250 mm), with acetonitrile-water (4:6 v/v) as mobile phase, flow rate 1 mL/min, monitored at 214 nm. The principal compound of this fraction was azadirachtin (5.03 and 1.1 mg/mL, respectively), the retention time was 9.5 min; it was confirmed using mass spectrophotometry. The L2 extract was partially fractionated by high performance liquid chromatograph (HPLC) in semi preparative C-18 column. The main fractions, analyzed by colorimetric methods, ESI-MS, were L2 initial and AZA2. The Rubus fruticosus cells (18-21 days; 1.8 g) were incubated in sodium citrate buffer containing L2, L2 initial ans AZA2 at concentrations up to 5 mg/mL, for 1h, at room temperature. After this period, the phenolic compounds, proteins and reducing sugar were determined in the extracellular and intracellular medium by colorimetric methods. Also, the effects of these fractions over the production of reactive oxygen species (ROS) in intact cell of Rubus fruticosus, was analyzed using 2,7-dichloro-fluorescein diacetate. AZA2 had no effect on the defense response. The initial L2 fraction increased the phenolic compounds in the intracellular medium and the reducing sugars in the extracellular medium. The same fraction showed an inhibitory effect on ROS and also increased the concentration of the elicitor. These results indicate the antioxidant potential and protector effect of the L2 initial. The L2 extract also demonstrated antioxidant and protective potential of cells with the increase of the elicitor concentration. Therefore, in parallel with its insecticide action, the neem extract contributes to the self-defense ability of the plants.
 
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Publishing Date
2009-09-25
 
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