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Doctoral Thesis
DOI
Document
Author
Full name
Anelise Stella Ballaben
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2019
Supervisor
Committee
Darini, Ana Lucia da Costa (President)
Barth, Afonso Luis
Kress, Marcia Regina von Zeska
Camargo, Ilana Lopes Baratella da Cunha
Falcão, Juliana Pfrimer
Moreira, Cristiano Gallina
Title in Portuguese
Estudo genético da resistência aos antibióticos beta-lactâmicos, quinolonas e aminoglicosídeos em bactérias isoladas de pacientes com suspeita de meningite no Estado de São Paulo
Keywords in Portuguese
16S-RMTase
AMEs
beta-lactamases
LCR
meningite
PMQR
Abstract in Portuguese
No Brasil, existem poucos relatos de membros da Ordem Enterobacterales isoladas de líquido céfalo raquidiano causando meningite. Nos últimos 20 anos, bacilos gram-negativos (BGN) produtores de beta-lactamases se tornaram um dos principais desafios para o tratamento das infecções, principalmente pela pandemia das enzimas CTX-M e KPC. Este trabalho teve como objetivo investigar a genética e epidemiologia molecular da resistência aos antibióticos de importância clínica no tratamento de infecções causadas por membros da Ordem Enterobacterales e bacilos gram-negativos não fermentadores (BGN-NF) isolados de pacientes com suspeita de meningite no Estado de São Paulo. Foram estudados 66 isolados de membros da Ordem Enterobacterales e BGN-NF resistentes aos antibióticos beta-lactâmicos de amplo espectro cujas investigações microbiológicas foram previamente realizadas nos Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão Preto e São Paulo. Essas bactérias foram isoladas de sangue e LCR de pacientes com suspeita de meningite, no período de 2007 a 2014. Os genes codificadores de beta-lactamases, determinantes de resistência às quinolonas mediada por plasmídeos (PMQR) e 16S RNA metiltransferase ribossômica (16S-RMTase) assim como a tipagem dos plasmídeos foram pesquisados por PCR e confirmados por sequenciamento. Além disso, a tipagem molecular dos isolados foi realizada por sequenciamento de multilocus (MLST). A determinação cromossômica ou plasmideal dos genes de resistência de interesse foi avaliada por I-Ceu-I-PFGE ou S1-PFGE, respectivamente. Experimentos de clonagem, transformação, conjugação e inibição de bombas de efluxo assim como pesquisa molecular de determinantes de virulência e sequenciamento do genoma completo também foram realizados. Entre os 66 isolados, 39 foram identificados como BGN-NF sendo 21 Acinetobacter baumannii, 11 Pseudomonas aeruginosa, 1 Pseudomonas putida, 3 Stenotrophomonas maltophilia e 3 Ochrobactrum antrophi, além de 27 membros da Ordem Enterobacterales, sendo 17 Klebsiella pneumoniae, 5 Klebsiella aerogenes, 2 Klebsiella oxytoca, 2 Enterobacter cloacae e 1 Serratia marcescens. Entre os 21 isolados de A. baumannii, 17 possuíam upstream ao gene blaOXA-23-like o elemento de inserção ISAba1. Plasmídeos AB-GR2, ii AB-GR4, AB-GR6 e AB-GR8 foram detectados em 9 isolados e 4 isolados apresentaram IncFrepB. No entanto, em todos isolados foi confirmada localização cromossômica de blaOXA-23-like. Por MLST foram detectados 9 ST diferentes, em dois singletons e três complexos clonais (CC). Entre os 11 isolados de Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa 1206/13 (ST1602) e P. aeruginosa 463/12 (ST235) apresentaram blaCTX-M-2 e no isolado 1206/13 blaGES-1 também foi detectado. Após análise dos dados obtidos por sequenciamento completo do genoma foi possível avaliar que blaGES-1 está organizado como gene cassete associado ao novo integron de classe I, In1600 no qual blaCTX-M-2-ISCR1 também estava associada, resultando em uma estrutura de ~11.680pb. Experimentos de S1-PFGE determinaram que ambos os genes bla estavam inseridos em plasmídeo IncP2 de ~340kb. Em P. aeruginosa 463/12, blaCTX-M-2 foi encontrado downstream à ISCR1 inserido no cromossomo do isolado. O gene blaIMP-16 foi detectado no isolado de P. putida. Os genes blaTEM, blaCTX-M-2, blaCTX-M-8, blaCTX-M-15 e blaKPC foram os mais detectados entre os isolados de Klebsiella sp. Entre os PMQR, apenas qnrB-1 foi encontrado. Ainda, estes isolados apresentaram grande diversidade de replicons, sendo colE e IncL/M os mais detectados. Foram encontrados diversos determinantes de virulência entre os isolados de K. pneumoniae, destes entB, iroD, fecIRA, ugE, wabG, fimH e ureA foram detectados em todos os isolados. Entre os 5 isolados de K. aerogenes, blaCTX-M-15, qnrB-1 e aac(6')-Ib foram encontrados em apenas 1 isolado. Além disso, outro isolado de E. cloacae apresentou hiperexpressão de AmpC. Diferentes plasmídeos Inc foram detectados entre os isolados de K. aerogenes e E. cloacae. Isolados que apresentaram fenótipo de alto nível de resistência aos aminoglicosídeos (HLAR) tiveram seus genomas sequenciados e os mecanismos de resistência foram investigados mais detalhadamente. Em alguns isolados, a combinação da produção de diferentes enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs) ocasionou no fenótipo HLAR apresentado, enquanto em outros, produção de 16S-RMTase foi detectada. Além disso, presença de hiperexpressão de bombas de efluxo também foi encontrada entre os isolados.
Title in English
Genetic study of resistance to beta-lactam, quinolones and aminoglycosides in bacteria isolated from patients with suspected meningitis in the State of São Paulo
Keywords in English
16S-RMTase
AMEs
beta-lactamases
CSF
meningitis
PMQR
Abstract in English
In Brazil, there are few reports of members of the order Enterobacterales-causing meningitis. Over the last 20 years, beta-lactamase-producing gram-negative bacilli (BGN) have become a major challenge in the treatment of infections caused by CTX-M-and KPC-producing isolates. This work aimed to investigate the genetic and molecular epidemiology of resistance to antibiotics in members of the order Enterobacterales and non-fermentative gram-negative bacilli (BGN-NF) isolated from patients with meningitis in São Paulo State. Sixty-six members of the order Enterobacterales and BGN-NF resistant to broad-spectrum beta-lactam antibiotics were studied. The microbiological investigations were previously performed at the Adolfo Lutz Institute in Ribeirão Preto and São Paulo. These bacteria were isolated from blood and CSF from patients with suspected meningitis from 2007 to 2014. The genes coding for beta-lactamases, plasmid mediated quinolone resistance (PMQR) and 16S ribosomal RNA methyltransferase (16S-RMTase) as well as plasmids typing were screened by PCR and confirmed by sequencing. In addition, molecular typing was performed by multilocus sequencing (MLST). The chromosomal or plasmid localization of the resistance genes was evaluated by I-Ceu-I-PFGE or S1-PFGE, respectively. Cloning experiments, transformation, conjugation and inhibition of efflux pumps as well as molecular investigation of virulence determinants and whole genome sequencing were also performed. Among the 66 isolates, 39 were identified as BGN-NF being 21 Acinetobacter baumannii, 11 Pseudomonas aeruginosa, 1 Pseudomonas putida, 3 Stenotrophomonas maltophilia and 3 Ochrobactrum antrophi; besides 27 members of the order Enterobacterales, being 17 Klebsiella pneumoniae, 5 Klebsiella aerogenes, 2 Klebsiella oxytoca, 2 Enterobacter cloacae and 1 Serratia marcescens. Among 21 A. baumannii isolates, blaOXA-23-like upstream to ISAba1 was detected in 17 isolates. Plasmids AB-GR2, AB-GR4, AB-GR6 and AB-GR8 were detected in 9 isolates while 4 isolates showed IncFrepB. However, in all isolates, chromosomal location of blaOXA-23-like was confirmed. Four different sequence typing (ST) were detected: two ST407 and ST690 singletons, three clonal complexes (CC), ST225 and ST438 (CC103), ST231 and ST442 (CC109), ST227, ST233 and ST783 (CC113). Among the 11 P. aeruginosa, iv P. aeruginosa 1206/13 (ST1602) and P. aeruginosa 463/12 (ST235) presented bla genes, blaCTX-M-2 was detected in both isolates and blaGES-1 only in isolate 1206/13. Sequencing data revealed blaGES-1 organized as a cassette gene associated with the new class I integron, In1600 in which blaCTX-M-2 downstream to ISCR1 which was also associated with the same In1600, resulting in a ~ 11,680 bp structure. S1-PFGE experiments determined that both bla genes were inserted into ~340kb IncP2 plasmid. Regarding P. aeruginosa 463/12, blaCTX-M-2 was also found downstream to ISCR1 inserted into the chromosome of the isolate. IMP-16-producing P. putida was detected among the isolates. The blaTEM, blaCTX-M-2, blaCTX-M-8, blaCTX-M-15 and blaKPC genes were the most detected among Klebsiella sp. Among the PMQRs, only qnrB-1 was found. Still, these isolates presented a great diversity of replicons, being colE and IncL/M the most detected ones. Several virulence determinants were found among K. pneumoniae isolates. Among the 5 K. aerogenes isolates, only 1 was CTX-M-15-producing isolate as well as qnrB-1 and aac(6')-Ib. In addition, one E. cloacae isolate showed AmpC overexpression. Different Inc plasmids were detected among K. aerogenes and E. cloacae isolates. Those isolates that presented a phenotype of high-level aminoglycoside resistance (HLAR) had their genomes sequenced and resistance mechanisms were investigated in detail. In some isolates, the combination of the production of different aminoglycoside-modifying enzymes (AMEs) resulted in the HLAR phenotype presented, whereas in others, 16S-RMTase production was detected. In addition, presence of hyperexpression of efflux pumps was also found among the isolates.
 
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Release Date
2021-09-03
Publishing Date
2019-11-14
 
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