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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.64.2009.tde-02102009-153144
Document
Auteur
Nom complet
Ana Paula Dini Andreote
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Piracicaba, 2009
Directeur
Jury
Coutinho, Luiz Lehmann (Président)
Alvares, Lucia Elvira
Silva, Luis Felipe Prada e
Titre en portugais
Identificação de microRNAs na musculatura esquelética de Gallus gallus
Mots-clés en portugais
Biblioteca de microRNAs
Expressão gênica
PCR quantitativa
Resumé en portugais
Os microRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs não codificadores, de cerca de 20 bases de comprimento, capazes de regular negativamente a expressão gênica após a transcrição. A ação regulatória destas moléculas é indispensável para o funcionamento adequado de diversos processos biológicos, dentre eles o desenvolvimento e a manutenção da musculatura esquelética. Com o objetivo de caracterizar a população de miRNAs presentes na musculatura esquelética adulta de frangos, foi construída uma biblioteca de miRNAs a partir do músculo peitoral de indivíduos jovens (21 dias pós-eclosão). Um total de 576 clones foi sequenciado e as sequências obtidas foram agrupadas por similaridade em 98 grupos, dentre os quais 47 corresponderam à miRNAs conhecidos, 30 à outros tipos de RNA e seis à possíveis novos miRNAs. Estes dados poderão subsidiar estudos funcionais subsequentes, que visem entender a função exercida por cada uma destas moléculas na musculatura esquelética. Buscando-se associar a ocorrência e expressão dos miRNAs ao controle da miogênese, foi analisada a expressão de três miRNAs identificados na biblioteca (miR-125b, miR-221 e miR-206), envolvidos na regulação do balanço entre proliferação e diferenciação celular, mecanismo determinante da miogênese. A análise foi realizada por PCR quantitativa em diferentes estádios do desenvolvimento (nove e 17 dias embrionário e 21 dias pós-eclosão) e entre duas linhagens de frango com potencial divergente para crescimento e ganho de massa muscular. Não houve diferença significativa na expressão dos miRNAs entre as linhagens em nenhum dos estádios aferidos, entretanto, foi possível traçar a ontogenia destas moléculas ao longo do desenvolvimento do animal, o que permitiu inferências sobre as condições morfológicas e fisiológicas das células musculares em cada um dos estádios analisados. Por fim, com o objetivo de associar os dados de expressão obtidos para os miRNAs, à variações na expressão de genes alvo, aferimos a expressão de três genes: SRF, Fstl e Pola1; onde o primeiro é regulado pelo miR-133a (cuja expressão não foi aferida devido à questões metodológicas) e os dois últimos pelo miR-206. A análise foi feita também por PCR quantitativa, entre as linhagens e em diferentes estádios do desenvolvimento. Foi possível visualizar, apenas nos estádios embrionários, a relação entre a expressão do miR-206 e seus genes alvo, com uma coerência entre o aumento na expressão do miR-206 e a diminuição na expressão de Pola1 e Fstl1. A determinação do perfil de expressão dos três genes ao longo do desenvolvimento muscular permitiu inferências sobre a ação destas moléculas no balanço entre proliferação e diferenciação nas linhagens de corte e postura
Titre en anglais
Identification of microRNAs from Gallus gallus skeletal muscle
Mots-clés en anglais
Gene expression
MiRNAs libraries
Quantitative PCR
Resumé en anglais
MicroRNAs (miRNAs) represent a class of small and noncoding RNAs, about 20-nucleotides long that negatively regulate gene expression posttranscriptionally. The regulatory action of these molecules is essential for the proper functioning of various biological processes, including the development and maintenance of skeletal muscles. To identify miRNAs that might be important for the skeletal muscle development, we constructed a miRNA library from pectoral skeletal muscle of 21º days after birth chickens. A total of 576 clones were sequenced and these sequences were collapsed into 98 clusters. Sequence analysis identified 47 small RNAs that show significant similarities with published miRNAs, 30 with others noncoding RNAs and six sequences clusters could be identified as potentially novel miRNAs. These data may support subsequent functional studies aimed at understanding the function performed by each of these molecules in skeletal muscle of chicken. To further associate the miRNA presence with the gene expression in the controlling of myogenesis the expression patterns of tree miRNAs identified in the library (miR-125b, miR-221 e miR-206) were analyzed. These miRNAs are involved in the balance between proliferation and differentiation mechanisms that control myogenesis. The expressions of these miRNAs were measured using quantitative RT-PCR. We analyzed samples from two embryos stages (9 and 17 days) and one adult stage (21º days after birth) in two chicken lines with different potential to growth and gain of muscle mass. There were no significant differences between the lines about these miRNAs expression. But, we could predict an overview of these miRNAs expressions during the muscle development of chicken, which allowed inferences about the physiologic and morphologic conditions of the muscles cells in each analyzed stage. Also, to further associate the miRNAs results to variations in the target genes expressions, we analyzed the expression of three genes: SRF, Fstl e Pola1. The first one is target of miR-133a (not analyzed due to methodological problems), and the others are target of miR-206. We analyzed by quantitative RT-PCR different stages and two chicken lines. It was possible to observe, only in the earlier stages, a relationship between the miR-206 expression and the Pola1 and Fstl1 expression, with a consistency between the increased expression of mir-206 and decrease in expression of Pola1 and Fstl1. The determination of the profile of these three gene expressions during the muscle development allowed inferences about the action of these molecules in the balance between proliferation and differentiation process in chicken strains for broiler and layer
 
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Date de Publication
2009-10-14
 
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