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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.64.2020.tde-07022020-174323
Document
Auteur
Nom complet
Guilherme Faganello Dressano
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Piracicaba, 2019
Directeur
Jury
Figueira, Antonio Vargas de Oliveira (Président)
Caldas, Danielle Gregorio Gomes
Wood, Ana Karla Machado
Titre en portugais
Análise da capacidade de silenciamento gênico de Moniliophthora perniciosa como método de controle
Mots-clés en portugais
Inibidor da oxidase alternativa mitocondrial
Moniliophtora perniciosa
Silenciamento gênico
Resumé en portugais
O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é o agente causal da doença conhecida como "vassoura-de-bruxa", que afeta o cacaueiro (Theobroma cacao) e é um dos principais detratores da produtividade desta cultura no Brasil e no mundo. Os danos ao desenvolvimento do cacaueiro resultantes da infecção por este fitopatógeno incluem a podridão dos frutos e a indução de brotações laterais nos ramos infectados, resultando no enfraquecimento geral das plantas. Os métodos de controle dessa doença, como resistência genética, podas fitossanitárias e controle químico não se mostraram satisfatórios até o momento. Dadas as particularidades deste patossistema, uma das alternativas que se vislumbra é o desenvolvimento de compostos biologicamente ativos em rotas metabólicas essenciais ao fungo e, portanto, capazes de reduzir os danos causados pela doença. Na fase biotrófica de M. perniciosa, descobriu-se que a via alternativa de transferência de elétrons desempenhada pela enzima oxidase alternativa mitocondrial (AOX) é importante para a produção de ATP e resistência a fungicidas, e trabalhos recentes demonstraram que o uso in vitro e in vivo de compostos inibidores desta enzima reduziram a viabilidade de esporos de M. perniciosa. Neste trabalho, foi proposta nova abordagem in vivo de condução de ensaios para avaliação de inibidor da enzima AOX sobre a patogenicidade de M. perniciosa no tomateiro 'Micro-Tom' (MT) fornecido via radicular por meio de solução nutritiva. Por outro lado, o entendimento dos mecanismos de infecção de fungos fitopatogênicos abre caminho para novas estratégias de controle. Relatos recentes em outros patossistemas sugerem que, além de proteínas efetoras, patógenos empregam pequenos RNAs (sRNA) para manipulação direta do sistema de defesa vegetal. Já foi demonstrado que hospedeiros expressando RNA dupla fita correspondendo a genes alvos do patógeno, incluindo fungos filamentosos, podem gerar pequenos RNAs interferentes (siRNA) que levam ao silenciamento desses genes alvo, denominada HIGS (Host Induced Gene Silencing). Neste projeto buscou-se confirmar a presença da maquinaria genética para produção e processamento de pequenos RNAs (sRNA) e o mecanismo de RNA de interferência no genoma de M. perniciosa. Além disso, a planta modelo tomateiro 'Micro-Tom' (MT) foi transformada geneticamente para expressar uma das componentes chaves deste mecanismo (enzimas Dicers) visando entender seu papel na patogenicidade de M. perniciosa em futuros estudos. Como resultados, tem-se que o inibidor da enzima oxidase alternativa (AOX) '7j-41' administrado preventivamente a inoculação por basidiosporos de M. perniciosa foi efetivo em reduzir a severidade da infecção e proteger a produção de biomassa das plantas do efeito deletério do patógeno. Descobriu-se que M. perniciosa tem em seu genoma genes participantes da rota de silenciamento gênico canônico descrita em fungos, incluindo três Dicers (DCL), 10 Argonautas (AGO) e sete RNA-polimerase dependente de RNA (RdRPs). Alguns genes de cada grupo se mostraram principalmente expressos nas fases de micélio monocariótico, dicaríotico, primórdio e basidiomata, sugerindo importância em etapas da interação planta-patógeno. Obteve-se com sucesso plantas de tomateiro 'Micro-Tom' transgênicas com a construção concatenada contendo fragmentos das três Dicers do fungo, a partir de onde se poderá em futuros trabalhos avaliar se M. perniciosa emprega sRNAs como efetores de virulência em tomateiro MT
Titre en anglais
Gene silencing analysis as a control method against Moniliophthora perniciosa
Mots-clés en anglais
Alternative oxidase inhibitor
Gene silencing
Moniliophtora perniciosa
Resumé en anglais
The Basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa is the causal agent of the disease known as "witch's broom disease", which affects cacao tree (Theobroma cacao) and is one of the main detractors of the productivity of this crop in Brazil and worldwide. The damage to cacao trees resulting from infection by this plant pathogen includes fruit rot and induction of lateral shoots in the infected branches, resulting in general weakening of the plants. Control methods of this disease, such as genetic resistance, phytosanitary pruning and chemical control have been shown to be palliative measures. Given the peculiarities of this pathosystem, one of the envisioned alternatives is the development of biologically active compounds on essential metabolic pathways capable of reducing the damage caused by the disease. In the biotrophic phase of M. perniciosa, it has been found that the alternative electron transfer pathway played by the enzyme alternative mitochondrial oxidase (AOX) is important for ATP production and fungicide tolerance. Recently, it was shown that in vitro and in vivo inhibiton of this enzyme reduced the viability of M. perniciosa spores. In this work, a new in vivo approach is purposed for the evaluation of AOX synthetic inhibitor to assess its efficacy against M. perniciosa in the tomato model 'Micro-Tom' (MT), sourced by roots via nutrient solution. On the other hand, understanding the mechanisms of phytopathogenic fungi infection paves the way for new control strategies. Recent reports in other pathosystems suggest that, in addition to effector proteins, pathogens employ small RNAs (sRNA) for direct manipulation of the plant defense system. Hosts expressing double-stranded RNA corresponding to target genes of the pathogen, including filamentous fungi, have been shown to generate small interfering RNAs (siRNA) that lead to the silencing of these target genes, in an approach named Host Induced Gene Silencing (HIGS). This project aimed to confirm the presence of genetic machinery for the production and processing of small RNAs (sRNA) and the RNA interference mechanism in the M. perniciosa genome. In addition, the 'Micro-Tom' (MT) model tomato was genetically transformed to express one of the key components of this mechanism (Dicers enzymes) to understand its role in the pathogenicity of M. perniciosa in future studies. As a result, alternative oxidase inhibitor (AOX) '7j-41' preventively administered to inoculation of M. perniciosa basidiospores was effective in reducing the severity of infection and protecting plant biomass from the deleterious effects of the pathogen. M. perniciosa has in its genome genes participating in the canonical gene silencing pathway described in fungi, including three Dicers (DCL), 10 Argonauts (AGO), and seven RNA-dependent RNA polymerase (RdRPs). These genes were mainly expressed in the monocariotic, dicariotic, primordial and basidioma mycelium phases, suggesting importance in several stages of plant-pathogen interaction. Transgenic 'Micro-Tom' tomato plants have been successfully obtained with the concatenated construction with fragments of the three fungus Dicers, from which it will be possible to further evaluate whether M. perniciosa employs sRNAs as virulence effectors in MT tomato
 
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Date de Publication
2020-03-10
 
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