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Tesis Doctoral
DOI
10.11606/T.64.2010.tde-18052010-140046
Documento
Autor
Nombre completo
Andréa Dias Koehler
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Piracicaba, 2010
Director
Tribunal
Martinelli, Adriana Pinheiro (Presidente)
Dusi, Diva Maria de Alencar
Goldman, Maria Helena de Souza
Valle, Cacilda Borges do
Vincentz, Michel Georges Albert
Título en portugués
Reprodução em Brachiaria spp.: SERK (Somatic Embryogenesis Receptor-Like Kinase) no desenvolvimento da antera, do ovário e na embriogênese
Palabras clave en portugués
Cultura de tecidos
Expressão gênica
Forrageiras
Melhoramento genético vegetal
Resumen en portugués
Gramíneas do gênero Brachiaria apresenta importância econômica como forrageiras no Brasil. O melhoramento genético, entretanto, é restrito devido a diferenças de ploidia entre os genótipos e a reprodução por apomixia. A indução de haplóides e duplo-haploides pelo cultivo in vitro de anteras ou de micrósporos isolados é relatada em diversas espécies. Além da criação de novos genótipos linhagens duplo-haplóides podem ser utilizadas como ferramentas para o estudo de marcadores moleculares. Dentre os fatores essenciais para o sucesso da técnica está o estádio do desenvolvimento do micrósporo, sendo o estádio uninucleado, geralmente, o mais responsivo. Um dos objetivos deste trabalho foi contribuir para a definição de parâmetros para a cultura de haplóides em Brachiaria. Flores e anteras isoladas de B. brizantha (B105) em diferentes estádios de desenvolvimento foram processadas para microscopia de luz. Os eventos observados foram associados a marcadores morfologicos. Experimentos de cultura de anteras foram estabelecidos e estruturas semelhantes a calos ocorreram em pouco explantes. Secções histológicas revelaram a ocorrência de micrósporos com divisão simétrica, indicando um possível desvio da rota do micrósporo para a rota esporofítica. Genes definidos como marcadores de embriogênese como SERK (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE), podem ser utilizados para identificar o potencial embriogênico de células ou grupo de células, possibilitando monitorar a resposta in vitro. Duas seqüências parciais de cDNA isoladas de B. brizantha apresentaram alta identidade com homólogos de SERK1 e SERK2 de monocotiledôneas. Análise filogenética confirmou a alta similaridade sugerindo serem os possíveis ortólogos de SERK em Brachiaria, sendo nomeados como BbrizSERK1 e BbrizSERK2. Clones parciais da seqüência genômica foram obtidos. Análise de Southern blot identificou duas cópias deste gene tanto na planta apomítica como na sexual. A análise da expressão de BbrizSERK2 por RT-qPCR na planta apomítica e sexual e durante a embriogênese somática revelou que este gene não é específico de tecidos reprodutivos. Expressão diferencial de BbrizSERK entre ovários apomíticos e sexuais, especialmente durante a megasporogênese, foi observada por hibridização in situ. Detectou-se forte sinal na célula-mãe do megásporo em ovários sexuais e ausência de sinal em ovários apomíticos. Após a antese, a expressão na planta apomítica foi observada apenas na região micropilar e proembriões. Na sexual, foi observada nas antípodas e aparato da oosfera. Em anteras o mesmo padrão de expressão foi observado entre a planta apomítica e sexual, com forte expressão no tapete e nas células-mãe do grão de pólen, o que sugere um importante papel deste gene na esporogênese em Brachiaria. Em calos embriogênicos forte sinal foi observado em massas proembriogênicas, em embriões globulares e também em embriões somáticos mais desenvolvidos, confirmando a função de SERK como marcador de embriogênese em Brachiaria. Em anteras cultivadas in vitro, forte sinal foi observado em micrósporos binucleados com divisão simétrica e em alguns micrósporos vacuolados. Experimentos futuros com genes desta família poderão contribuir para monitorar processos in vitro em Brachiaria, indicando células ou grupos de células com potencial embriogênico, ajudando na definição das melhores condições de cultivo para a embriogênese e também para o estudo da reprodução neste gênero
Título en inglés
Reproduction in Brachiaria spp.: SERK (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE) in anther and ovary development and in embryogenesis
Palabras clave en inglés
Forage
Gene expression
Plant breeding
Tissue culture
Resumen en inglés
Brachiaria, gramineae present economic importance as forage in Brazil. The genetic breeding, however, is restricted by differences in ploidy among the genotypes and the apomixis. The development of a haploid and double haploid production has been reported for several species. Besides the production of new genotypes the development of double haploid lineages may be used for studies with molecular markers. Among important factors for the success of haploid plant development relies on the microspore developmental stage, with the uninucleate stage being usually the most responsive. One of the objectives of this work was to contribute for the definition of parameters for the development of haploid cultures in Brachiaria. B. brizantha (B105) flowers and isolated anthers were collected in different stages of development and processed for light microscopy. The events observed were associated to morphological markers. Anther culture experiments were established and calli formation ocurred to a few explants. Histological sections of anthers cultivated in vitro, however, revealled the occurrence of microspores with symmetrical divisions, indicating a possible alternative to the sporophytic route. Genes defined as markers of embryogenesis, such as SERK (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE), may be utilized to identify the embryogenic potential of cells, or cell clusters, in an attempt to monitor the in vitro response. Two partial sequences of cDna isolated from B. brizantha (B30) showed high identity of these two sequences to SERK1 and SERK2 homologs from monocots. The phylogenetic analysis confirmed high similarity with these genes, indicating that these sequences are possible orthologs of SERK in Brachiaria, hence these were named BbrizSERK1 and BbrizSERK2. Partial clones of genomic sequences were obtained. Southern blot analysis suggested two copies of this gene in both apomictic and sexual B. brizantha. The expression analysis of BbrizSERK2 by RT-qPCR revealed that this gene is not specific to reproductive tissues. Differential expression of BbrizSERK between apomictic and sexual ovaries, especially during megasporogenesis, was observed by in situ hybridization. A strong signal was detected in the megaspore mother cell in sexual ovaries, with absence in apomictic ovaries. After anthesis, the expression in the apomictic plant was observed only in the micropylar region and proembryos, however, in the sexual plant, the expression was observed in the antipodals and egg apparatus. In anthers, the same in situ pattern was observed in the apomictic and the sexual plant, with a strong expression in the tapetum and the pollen grain mother cell, suggesting an important role of this gene in the sporogenesis in Brachiaria. In embryogenic calli, strong signal was observed in proembryogenic masses, globular embryos and somatic embryos in later stages of development, confirming the role of SERK as an embryogenic marker in Brachiaria. In cultivated anthers, a strong signal was observed in binuclear microspores with symmetric division and vacuolated microspores. Further studies with this gene family may contribute to monitoring the in vitro processes in vitro in Brachiaria, defining cells or cell clusters with an embryogenic potential, helping for the definition of culture conditions for embryogenesis and also for reproductive studies in this genus
 
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Errata.pdf (7.32 Kbytes)
Fecha de Publicación
2010-05-18
 
ADVERTENCIA: El material descrito abajo se refiere a los trabajos derivados de esta tesis o disertación. El contenido de estos documentos es responsabilidad del autor de la tesis o disertación.
  • BERTINI, PPI, et al. Caracterização morfo-anatômica do processo germinativo em Brachiaria brizantha. In Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP, 14, Piracicaba, 2006.
  • KOEHLER, AD, et al. Anatomical characterizat of anthers and pollen during development in vivo-in vitro of Brachiaria sp. In Simpósio de Microscopia no Cerrado, Pirenópolis, GO, 2008.
  • KOEHLER, AD, et al. Clonagem e caract de cDNA do gene SERK expresso no processo apomítico de B. brizantha. In Encontro Talento Estudantil, 12, Brasilia, DF, 2007.
  • KOEHLER, AD, et al. Expression of SERK (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE) genes in Brachiaria brizantha. In International Plant Molecular Congress, 9, Saint Louis, 2009.
  • KOEHLER, AD, et al. Isolamento e caracterização de cDNA parcial do gene SERK expresso durante o processo apomítico em B. In Simpósio Internacional de Biologia do Desenvolvimento, 3, Uberlândia, 2007.
  • KOEHLER, AD, et al. Isolation and characterization of a SERK cDNA from the apomictic Brachiaria brizantha. In , , .
  • Bertini, P. P. I., et al. Caracterização morfo-anatômica do processo germinativo em Brachiaria brizantha. In 14 Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP, Ribeirão Preto, 2006. Resumos do 14 Simpósio Internacional de Iniciação Científica da USP.São Paulo : USP, 2006. Resumo.
  • Carneiro, V. T. C., et al. Molecular analysis of apomixis in a tropical forage grass. In Simpósio Brasileiro de Genética Molecular de Plantas, Búzios, RJ, 2009. Programa e Resumos do II Simpósio Brasileiro de Genética Molecular de Plantas., 2009. Abstract.
  • Dusi, D. M. A., et al. Developing biotechnological tools to study apomixis in Brachiaria. In II Simposio Interacional sobre Melhoramento de Forrageiras, Campo Grande, MS, 2009. Anais do II Simposio Interacional sobre Melhoramento de Forrageiras.Campo Grande, MS : Embrapa Gado de Corte, 2009. Abstract.
  • Koehler, A. D., et al. Anatomical characterization of anthers and pollen during development in vivo and in vitro of Brachiaria sp. In Simpósio de Microscopia no Cerrado, Pirenópolis, GO, 2008. SMC Documents.Brasilia, DF : Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2008. Resumo.
  • Koehler, A. D., et al. Anther development and anther culture in Brachiaria sp.. In Pollen Biotech 2013: Pollen Biotechnology, Diversity and Function in a Changing Environment, Madrid, Spain, 2013. Abstracts., 2013. Abstract.
  • Koehler, A. D., et al. Clonagem e caracterização de cDNA correspondente ao gene SERK (Somatic Embryogenesis Receptor-Like Kinase) expresso durante o processo apomítico em Brachiaria brizantha. In XII Encontro Talento Estudantil 2007, Brasília, DF, Brasil, 2007. XII Encontro Talento Estudantil 2007.Brasília, DF, Brasil : EMBRAPA, 2007. Resumo.
  • Koehler, A. D., et al. Expression of SERK (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE) genes in Brachiaria brizantha. In IX International Plant Molecular Congress, Saint Louis, MO, USA, 2009. IX International Plant Molecular Congress - Abstracts., 2009. Abstract.
  • Koehler, A. D., et al. Isolamento e caracterização de cDNA parcial correspondente ao gene SERK (Somatic Embryogenesis Receptor-Like Kinase) expresso durante o processo apomítico em Brachiaria brizantha. In III Simpósio Internacional de Biologia do Desenvolvimento, Uberlândia, MG, Brasil, 2007. Resumos do III Simpósio Internacional de Biologia do Desenvolvimento., 2007. Resumo.
  • Koehler, A. D., et al. Isolation and characterization of a SERK (SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE) cDNA from the apomictic Brachiaria brizantha. In XX International Congress on Sexual Plant Reproduction, Brasilia, DF, Brasil, 2008. Documentos (Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologi) (Cessou em 19uu).Brasilia, DF, Brasil : Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2008. Abstract. Available from: http://www.cenargen.embrapa.br.
  • Prêmio Talento Estudantil 2009. Primeiro lugar na Categoria Pós-Graduação, em trabalho apresentado pela orientada de doutorado Andréa Dias Koehler - Embrapa - Recursos Genéticos e Biotecnologia
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