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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.64.2016.tde-26012016-150215
Document
Author
Full name
Fernanda Mancini Nakamura
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 2014
Supervisor
Committee
Mui, Tsai Siu (President)
Carmona, Eleonora Cano
Mendes, Rodrigo
Title in Portuguese
Bioprospecção de bactérias degradadoras de hidrocarbonetos aromáticos isoladas de biocarvão de Terra Preta de Índio da Amazônia Central
Keywords in Portuguese
Biodegradação
Biologia molecular
Cultivo de microrganismos
Ecologia microbiana
Abstract in Portuguese
Devido aos altos teores de húmus e matéria orgânica pirolisada, os solos de Terra Preta de Índio da Amazônia (TPA) apresentam uma dinâmica diferente de outros, com hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos em grandes quantidades. Os alcanos são os maiores constituintes da matéria orgânica do solo, pouco reativos, insolúveis e recalcitrantes, promovendo menor rendimento à produção de combustíveis fósseis e renováveis. Os hidrocarbonetos aromáticos, assim como alcanos, são encontrados no ambiente de forma natural ou introduzidos e podem ser tóxicos, mutagênicos ou carcinogênicos. O estudo das comunidades bacterianas desses locais é de interesse no entendimento da alta fertilidade destes solos e da ação do carvão na relação planta-solo-microrganismo, além de bioprospecções de novas vias metabólicas. Diversos estudos já avaliaram genes de interesse para biodegradação destes compostos na TPA, como bph (Brossi, 2014) em solo e ?-ARHDs (Germano, 2011) em solo e carvão, ambos para degradação de hidrocarbonetos aromáticos. Porém o gene alk, para degradação de alcanos, ainda não fora estudado em carvão de TPA e nenhum isolamento bacteriano deste carvão foi feito e o presente trabalho teve esta abordagem inovadora para os solos de TPA, aliando cultivo, biologia molecular e bioensaios. O carvão foi separado, diluído e plaqueado em cinco meios de cultivo, com posterior incubação microaerofílica. Ao final da obtenção dos isolados, uma seleção de singularidade de morfologia foi feita a fim de se trabalhar com riqueza de tipos bacterianos, resultando em 86 isolados. Na identificação molecular pelo gene 16S ribossomal bacteriano identificamos 24 gêneros: Burkholderia, Ralstonia, Pseudomonas, Achromobacter, Pantoea, Leclercia, Acinetobacter, Cupriavidus, Enterobacter, Variovorax, Leifsonia, Leclercia, Pantoea, Parapusiliimonas, Bordetella; Bacillus, Paenibacillus, Lysinibacillus, Brevibacillus, Rummeliibacillus; Arthrobacter, Streptomyces, Rhodoccocus; e Fibrobacterium, além de bactérias não cultivadas. Os meios GA e ES comprovaram ser um método com boa eficiência para isolamento de quantidade e variedade de bactérias do carvão, tanto aeróbias quanto anaeróbias facultativas, sendo pertencentes aos filos Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria e Bacteroidetes. Apenas 11 isolados possuem o gene alk. Observamos que 53,49% de isolados foram positivos para a degradação de 0,05% de fenantreno; 70,93% foram positivos para a degradação de 8% de óleo diesel; e 88,37% foram positivos para degradação de 0,05% de bifenil. Houve isolados com capacidade de degradar mais de um substrato, e até mesmo os 3 substratos. Este estudo demonstra que os biocarvões de TPA são um microhabitat para microrganismos com capacidade comprovada em metabolizar hidrocarbonetos aromáticos complexos e diversos como fonte de carbono e energia. Os isolados apresentam um grande potencial biotecnológico para a geração de moléculas ligadas aos processos metabólicos da biodegradação, principalmente os não-cultivados, podendo auxiliar processos de biorremediação de áreas contaminadas e, possivelmente, produção de biocombustíveis de segunda geração. Além disso, os dados gerados por este estudo fornecem informações sobre o papel dessas bactérias na ciclagem de nutrientes, que influenciam diretamente na resiliência e fertilidade dos solos de Terra Preta de Índio da Amazônia por serem capazes de degradar compostos recalcitrantes de carbono dos fragmentos de biocarvão, ácidos húmicos e, talvez, grupos funcionais aderidos, além de outras frações da matéria orgânica humificada
Title in English
Bioprospection of bacterial degraders of aromatic hydrocarbons isolated from biochar of Amazonian Dark Earths from Central Amazon
Keywords in English
Biodegradation
Microbial ecology
Microrganisms cultive
Molecular biology
Abstract in English
Due to high humus content and pyrolyzed organic matter, Amazonian Dark Earth Soils (ADE) show different dynamic than other soils, presenting high contents of aliphatic and aromatic hydrocarbons. Alkanes are the major constituents of soil organic matter, low reactive, insoluble and recalcitrant, promoting lesser yield on fossil and renovable fuels production, as well as pollute the environment when in high concentrations. Aromatic hydrocarbons, as well as alkanes, are found in environment due to natural e industrial processes, are insoluble and recalcitrants, and can be toxic, mutagenic and carcinogenic. The study of bacterial communities from these areas is of major interest to reveal the high fertility of these soils, and understand the biochar influences on the plant-soil-microrganism relation, besides discover novel bacteria, genes and proteins. Diverse studies had already evaluated genes of interest for the biodegradation of hydrocarbons on ADEs, like bph gene (Brossi, 2014) from soils and ?-ARHDs (Germano, 2011) from soils and biochar. However, the alk gene for the biodegradation of alkanes was never studied in biochar. Neither any bacterial isolation from the ADEs biochar was done until now, so this work has this innovative approach to the ADEs. Biochar was separated, dilluted and plated on five culture media, and microarophilic incubation. The isolates were selected by their morphology and 86 isolates were obtained. We identified 24 bacterial genera throught the 16S rRNA gene sequencing: Burkholderia, Ralstonia, Pseudomonas, Achromobacter, Pantoea, Leclercia, Acinetobacter, Cupriavidus, Enterobacter, Variovorax, Leifsonia, Leclercia, Pantoea, Parapusiliimonas, Bordetella; Bacillus, Paenibacillus, Lysinibacillus, Brevibacillus, Rummeliibacillus; Arthrobacter, Streptomyces, Rhodoccocus; and Fibrobacterium, in addition to uncultured-bacteria. GA and ES media were the best on variety and number of bacteria from biochar, such aerobic as well as facultative anaerobic bacteria, being from the phyla Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Bacteroidetes. The alk gene was found in 11 isolates. We observed 53,49% of isolates were positive for 0,05% phenanthrene degradation; 70,93% of isolates were positive for 8% diesel oil degradation; and88,37% of isolates were positive for 0,05% biphenyl degradation. There were isolates capable to degrade more than one substratum, even the three substrata. This study demonstrates that ADE biochars are a microhabitat for bacteria with proved capacity to metabolize complex aromatic hydrocarbons as carbon and energy sources. The isolates have great biotehcnological potential to generate molecules associated to metabolic process of biodegradation, mainly the uncultured ones, being helpfull for polluted areas bioremediation and, possibly, to the production of second generation biofuels. Furthermore, the generated data supplies the role of bacteria from ADE biochar on the nutrient cycle, wich directly influences the resiliance and fertility of ADEs, for microbiota being capable to degrade recalcitrant carbon fragments of biochar, humic acids and, possibly, adhered functional groups, besides other organic matter fractions, as well
 
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Publishing Date
2016-02-26
 
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