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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.74.2009.tde-19022009-114252
Document
Author
Full name
Mônica Ferreira Accorsi
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Pirassununga, 2009
Supervisor
Committee
Meirelles, Flávio Vieira (President)
Ferreira, Christina Ramires
Medina, Mônica Roberta Mazalli
Title in Portuguese
Avaliação de embriões bovinos cultivados in vitro na presença de ácidos graxos e sua sobrevivência pós-criopreservação
Keywords in Portuguese
Ácidos graxos
Criopreservação
Embriões bovinos in vitro
Abstract in Portuguese
Tendo em vista a possibilidade de que a adição de ácidos graxos ao meio de cultivo embrionário aumente a sobrevivência ao congelamento, a proposta deste trabalho foi avaliar o efeito da adição de quatro ácidos graxos isoladamente ao meio de cultivo, dois do grupo ômega 6 (ácido linoléico e ácido linoléico conjugado) e dois do grupo ômega 3 (ácido eicosapentaenóico e ácido docosahexaenóico), na produção de embriões, no número de células, na quantidade de lipídeos, na taxa de re-expansão da blastocele após 48 horas de cultivos pós-descongelamento, na taxa de eclosão pósdescongelamento e na taxa de gestação. Para tal, os oócitos bovinos colhidos de ovários de vacas abatidas foram maturados, fecundados e cultivados in vitro em atmosfera de 5% CO2 em ar, à 38,8°C e máxima umidade. No cultivo, foi adicionado isoladamente um destes ácidos graxos, e foram avaliadas a taxa de clivagem, e a produção de embriões no sétimo e oitavo dia de cultivo. No sétimo dia, os blastocistos expandidos foram congelados com 1,5M de etileno glicol. Eles permaneceram nesta solução por 9 minutos antes de serem envasados e seguirem para a maquina de congelamento numa taxa de resfriamento de 0,5°C/minuto até chegarem à temperatura de -32°C. Dos embriões que foram congelados, alguns seguiram para o descongelamento e voltaram para o cultivo in vitro para avaliação da reexpansão e taxa de eclosão pós-descongelamento. Outros foram transferidos para receptoras sincronizadas para avaliação da taxa de gestação. Outros grupos de embriões permaneceram até o oitavo dia de cultivo e foram corados com Hoechst 33342 para contagem dos núcleos, e corados com Nile Red para avaliação do conteúdo total de lipídeos. Em geral, a adição isolada de ácidos graxos do grupo ômega 6 (CLA e LA) na produção in vitro de embriões bovinos aumentou a taxa de sobrevivência ao congelamento (criotolerância), no entanto, não houve um aumento no número de células, nem diferença no conteúdo total de lipídeos nos embriões analisados. A taxa de gestação também não diferiu estatisticamente entre os grupos testados in vivo, porém foi observado um aumento de 200% na taxa de gestação dos embriões cultivados na presença de CLA. Novos estudos devem ser desenvolvidos para comprovar o efeito do aumento da criotolerância e melhorias nas taxas de gestações dos embriões, além de estudos da composição de lipídeos nos embriões e membranas.
Title in English
Assessment of bovine embryos grown in vitro in the presence of fatty acids and their survival after cryopreservation
Keywords in English
Bovine embryos in vitro
Cryopreservation
Fatty acids
Abstract in English
In the view of the possibility that the addition of fatty acids in the embryo growing medium increase the survival rate after cryopreservation, this study was proposed to evaluate the effect of the addition of four fatty acids in culture medium, two of the omega 6 group (linoleic acid and conjugated linoleic acid) and two of the omega 3 group (eicosapentainoic acid and docosahexaenoic acid), in the rate of production of blastocysts, blastocyst cell number, blastocyst amount of lipids , re-expansion of blastocele rate after 48 hours of culture post-thaw, post-thaw hatching rate and pregnancy rate. The oocytes obtained by punction of slaughterhouse cows were matured in vitro, fertilized in vitro and cultured in vitro in an atmosphere of 5% CO2 in air, to 38,8°C and maximum moisture. Fatty acids were supplemented individually and cleavage rate and production of embryos in the seventh and eighth days of culture were assessed. On seventh day, the expanded blastocysts were frozen with 1.5M of ethylene glycol. They remained in this solution for nine minutes before introduction in a straw followed and then in a freezing machine with a chilling rate of 0,5°C/minute until temperature of -32°C. Frozen embryos were then divide in two groups: one was thawed and returned to in vitro culture in other to assess the reexpansion and post-hatching rate, and other was transferred to synchronized recipients to assess the pregnancy rate. Another unfreezed group of embryos were stained with Hoechst 33342 for counting the nuclei, or stained with Nile Red to estimate the lipids contents. In general, the addition of fatty acids omega 6 group (LA and CLA) increased the survival rate to the freezing (cryotolerancy), however, there was no increase in the number of cells, or difference in the lipids contents. In the CLA treated embryos, the pregnancy rate of the freezed embryos did not differ from groups tested in vivo, but there was a 200% increase in the pregnancy rate. Further studies should be developed to prove the improvements in the rates of pregnancies of omega 6 treated embryos, besides a study of the composition of lipids of embryos and membranes should be conducted.
 
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Publishing Date
2009-02-19
 
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