• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.75.2010.tde-18052010-103045
Documento
Autor
Nome completo
Francisco Adriano de Oliveira Carvalho
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Carlos, 2010
Orientador
Banca examinadora
Tabak, Marcel (Presidente)
Canduri, Fernanda
Ramos, Carlos Henrique Inacio
Título em português
Estudo da hemoglobina extracelular gigante de Glossoscolex paulistus (HbGp) por ultracentrifugação analítica e fluorescência em função do pH
Palavras-chave em português
Glossoscolex paulistus
Coeficiente de sedimentação e subunidades
Massa molecular
Ultracentrifugação analítica
Resumo em português
A hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp) é homológa à hemoglobina da Lumbricus terrestris (HbLt). Baseado nos estudos de MALDI-TOF-MS foi determinada a massa molecular (MM) das subunidades da HbGp. Entretanto, ainda não era possível propor o valor exato da MM para a HbGp íntegra, pois a estequiometria deste oligômero ainda não era totalmente clara. Este trabalho objetiva avaliar a massa molecular do oligômero em dois estados de oxidação: oxi- e cianometa-HbGp, bem como avaliar a estabilidade desta proteína, ou seja, a dissociação e desnaturação em função do pH em meio ácido. O estudo por ultracentrifugação analítica permitiu uma avaliação independente da massa molecular da HbGp. Valores de MM de 3600 ± 100 e 3700 ± 100 kDa foram obtidos para a oxi- e cianometa-HbGp, respectivamente. Estes valores está de acordo com a massa esperada, assumindo a estequiometria proposta por Vinogradov para a HbLt. Os dados de ultracentrifugação para as amostras do monômero d puro mostraram um coeficiente de sedimentação de 1,95 ± 0,04 S para ambos os valores de pH 7,0 e 10,0. Além disso, as distribuições c (s) do monômero d puro indicaram que uma pequena contribuição (5%) de dímero de monômeros, d2, com valores de s020,w de 3,2 S estava presente em solução. Para a oxi-HbGp íntegra no pH 10,0 nenhuma contribuição em 58 - 59 S foi observada, sugerindo completa dissociação oligomérica. As distribuições c (s) mostraram dois picos adicionais em relação ao monômero puro: um pico em 4,2 - 4,4 S, que está associado ao trímero, abc; e um segundo pico em 5,8 - 6,0 S, que poderia ser associado ao tetrâmero, abcd. A adição de β-mercaptoetanol leva ao desaparecimento do pico em 4,2 S, consistente com a redução das pontes dissulfeto do trímero abc e produção dos monômeros a, b e c. Cerca de 19 % da forma cianometa-HbGp íntegra coexiste em equilíbrio com as subunidades dissociadas. Finalmente, estudos em meio ácido mostravam que na faixa de pH 5,0 - 7,0 as três formas de oxidação de HbGp apresentaram alta estabilidade oligomérica. Abaixo de pH 5,0 os dados de fluorescência mostrava que a estabilidade diminui na sequência cianometa > oxi > meta. Assim a estabilidade das formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp foi avaliada, ficando evidenciada a maior estabilidade da forma cianometa-HbGp.
Título em inglês
Studeis of the giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) by analytical ultracentrifugation and fluorencence as a function of pH
Palavras-chave em inglês
Glossoscolex paulistus
Analytical ultracentrifugation
Molecular mass
Sedimentation coefficient and subunits
Resumo em inglês
The giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) is homologous to Lumbricus terrestris (HbLt). Based on MALDI-TOF-MS the molecular masses (MM) of HbGp subunits were determined. However, the exact value of the MM for the HbGp oligomer is not known. This study has as a main goal to evaluate the molecular weight of the oligomer in two oxidation states: oxy- and cyanomet-HbGp. Also the stability of the protein dissociation and denaturation as a function of pH was monitored. The present analytical ultracentrifugation study allowed us to assess the molecular mass of the whole oligomer giving valores of MM of 3600 ± 100 and 3700 ± 100 kDa for the oxy- and cyanomet-HbGp, respectively. These values are in agreement with the expected mass based on Vinogradov model for HbLt. Data were obtained of so20, w for the pure monomer d as 1.95 ± 0.04 S for both pH values 7.0 and 10.0. C(s) distributions for pure monomer indicated that a small contribution of dimer of monomers (5%), d2, was also present with so20, w of 3.2 S in solution. For the whole oxy- HbGp at pH 10.0 no contribution at 58 - 59 S was observed, suggesting complete oligomeric dissociation. C(s) distribution showed two additional peaks as compared to pure monomer: a peak at 4.2 - 4.5 S, probably due to the trimer, abc; a second peak at 5.8 - 6.0 S, that could be associated to the tetramer, abcd. Addition of beta-mercaptoethanol leads to the disappearance of the peak at 4.2 S, consistent with the reduction of the trimer abc disulfide bridges and production of monomers a, b and c. It may be noted that about 19% of cyanomet-HbGp, undissociated, coexist in equilibrium with the isolated subunits. Finally, studies in acidic pH values show that in the pH range 5.0-7.0 the oligomeric stability for the three oxidation forms of HbGp is quite high. Below pH 5.0, fluorescence emission data suggest that the stability is reduced in the following order: cyanomet > oxy > met-HbGp. Thus the stability of the oxy-, meta- and cyanomet-HbGp forms was evaluated evidenced making it clear the higher stability of the cyanomet-HbGp.
 
AVISO - A consulta a este documento fica condicionada na aceitação das seguintes condições de uso:
Este trabalho é somente para uso privado de atividades de pesquisa e ensino. Não é autorizada sua reprodução para quaisquer fins lucrativos. Esta reserva de direitos abrange a todos os dados do documento bem como seu conteúdo. Na utilização ou citação de partes do documento é obrigatório mencionar nome da pessoa autora do trabalho.
Data de Publicação
2010-08-17
 
AVISO: Saiba o que são os trabalhos decorrentes clicando aqui.
Todos os direitos da tese/dissertação são de seus autores
Centro de Informática de São Carlos
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP. Copyright © 2001-2020. Todos os direitos reservados.