As abelhas são consideradas um importante agente para os serviços ecossistêmicos através do processo de polinização em culturas e plantas nativas, contribuindo expressivamente para a manutenção da biodiversidade. No entanto, a diminuição da população de abelhas em todo o mundo também está relacionada ao uso de agrotóxicos, afetando a saúde das abelhas e das colônias. Nesse sentido, estudos envolvendo a avaliação de efeitos adversos e a absorção dos agrotóxicos pelas abelhas são motivo de grande preocupação. Neste estudo foi desenvolvido um método analítico para a determinação do inseticida abamectina e do fungicida difenoconazol em tecidos da abelha sem ferrão Melipona scutellaris expostas via oral e tópica a três concentrações diferentes dos agrotóxicos. O método QuEChERS acetato modificado foi utilizado para o preparo das amostras, que na sequência foram analisadas por LC-MS/MS. Os parâmetros de validação do método desenvolvido incluíram: faixa linear entre 0,0100 a 1,00 µg mL^-1; e LD e LQ de 0,038 e 0,076 µg g^-1 para a abamectina e o difenoconazol. O acúmulo da abamectina e do difenoconazol via oral e tópica foi verificado nas abelhas testadas, principalmente quando o produto comercial foi utilizado. A mortalidade das abelhas foi maior para a exposição oral do que para a exposição tópica para ambos os agrotóxicos. Também foram avaliadas as respostas bioquímicas ao estresse da exposição aos agrotóxicos. As atividades da superóxido dismutase (SOD), glutationa S-transferase (GST), acetilcolinesterase (AChE) e os níveis de malondialdeído (MDA), dopamina e serotonina foram determinados nos tecidos das abelhas expostas aos agrotóxicos a fim de explorar as estratégias das abelhas para desintoxicação e tolerância. As respostas foram dependentes do tempo de exposição, da concentração dos agrotóxicos individuais e em mistura, bem como do uso de padrão de alta pureza ou produto comercial.