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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.76.1995.tde-06122013-142443
Documento
Autor
Nome completo
Luis Fernando Delboni
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Carlos, 1995
Orientador
Banca examinadora
Oliva, Glaucius (Presidente)
Arruda, Paulo
Fatini, Marcia Carvalho de Abreu
Nascimento, Otaciro Rangel
Tabak, Marcel
Título em português
Estrutura cristalográfica da enzima triosefosfato isomerase de Bacillus stearothermophilus e desenho racional de drogas contra a doença do sono
Palavras-chave em português
Cristalografia de proteínas
Estabilidade térmica de proteínas
Planejamento de fármacos
Resumo em português
O atual crescimento do número de estruturas tridimensionais de proteínas está produzindo um banco de dados de estruturas que é muito útil como ponto de partida para o desenvolvimento de novas moléculas relevantes do ponto de vista médico tais como drogas e vacinas. Neste trabalho, parte do projeto de desenvolvimento de novas drogas contra a doença do sono foi feita baseada nos estudos cristalográficos de ligação de compostos e de modelagem molecular de duas enzimas glicolíticas presentes no glicossomo de T. brucei. Como o alvo para novas drogas e o ciclo de glicólise, o qual também é presente nos seres humanos, o novo ligante deve ser seletivo. Frutose-1,6-bisfosfato aldolase (ALDO) é uma das proteínas alvo para o desenho racional de drogas. A análise estrutural e estudos cristalográficos da ALDO de T. brucei foram feitos, através do uso de proteína produzida em grandes quantidades por via recombinante. Vários possíveis sítios de seletividade foram encontrados em ALDO de T. brucei quando comparada as três seqüências das isoenzimas humana, tendo como base a estrutura tridimensional da isoenzima ALDO A. O braço flexível da região C-terminal é um forte alvo para compostos seletivos devido a não-conservação das seqüências. Cristais foram crescidos e padrões de difração de raios-X foram obtidos até 3.0Å, mas ainda os cristais são pequenos e mostram-se sensíveis a radiação. Triosefosato isomerase (TIM) é outra ptoteína alvo analisada neste trabalho. A estrutura da TIM de T. brucei é conhecida a alta resolução. Cristais de proteína expressa em bactérias foram obtidos após extensivos experimentos. Foi identificado que usar proteína recentemente preparada é essencial para obter cristais que apresentem boa qualidade de difração. Depois de obtidos cristais de proteína expressa em grades quantidades, foram feitos experimentos de difusão de novos inibidores, coleta de dados de difração e análises das estruturas dos possíveis complexos. A conhecida estrutura em volta flexível da TIM fecha quando se liga o substrato ou um inibidor análogo ao substrato no sítio ativo. Desenho racional de drogas tem sido seguido usando como padrão a conformação fechada da estrutura em volta. No entanto, com a obtenção de um novo complexo, no qual a estrutura em volta adota a conformação aberta foi feita uma busca de novos compostos em bancos de dados, que não fossem derivados de fosfatos e fosfoantos, através do programa DOCK. Com este procedimento são propostos novos compostos guia os quais serão utilizados no ciclo do desenho racional de drogas. A estrutura da triosefosfato isomerase de Bacillus stearothermophilus que apresenta estabilidade térmica em complexo com o inibidor competitivo 2PG foi determinada por cristalografia de raios-X à resolução de 2.8Å. A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando o programa XPLOR. Promediação da densidade eletrônica de ordem dois e nivelamento do solvente foram aplicados para melhorar a qualidade do mapa. Ambos os sítios ativos estavam ocupados pelo inibidor e a estrutura emvolta flexível adota a conformação fechada em ambas as subunidades. O fator cristalográfico R é de 17,6% com boa geometria. Bacillus stearothermophillus é considerado um organismo de estabilidade térmica moderada. Encontram-se disponíveis cinco estruturas de triosefosfato isomerase de organismos mesofílicos. A estrutura obtida neste trabalho é a primeira TIM reportada que apresenta estabilidade térmica. Vários artigos têm listados fatores de estabilidade térmica, os quais foram analisados em todas as estruturas de TIM disponíveis. Neste trabalho foi conduzida uma comparação entre a estrutura termofílica e as mesofílicas disponíveis, da qual se concluiu que a interação hidrofóbica na formação do dímero, e o alto número de prolinas são os mais importantes fatores que contribuem para a estabilidade térmica da TIM de B.stearothermophilus. Também concluiu-se que a razão Arg/(arg+Lys) é elevada em TIM de B. stearothermophilus mais devido ao baixo número de lisinas do que a um alto número de argininas. Analisou-se as argininas na TIM de B. stearothermophilus como também as interações das argininas e lisinas em todas as outras estruturas de TIM e não foi possível relacionar o valor aumentado da razão Arg/(arg+Lys) com a estabilidade térmica, fator este indicado anteriormente como importante para a estabilidade térmica
Título em inglês
Crystallographic structure of the enzyme triosephosphate isomerase from Bacillus stearothermophilus and rational drug design against sleeping sickness disease
Palavras-chave em inglês
Drug design
Protein crystallography
Protein termal stability
Resumo em inglês
The current growth in the number of known 3-dimensional proteins structures is producing a database of structures that is very useful as starting point for the development of new medically relevant molecules such as drugs and vaccines. In this work part of the project of developing new drugs against the sleeping sickness has been done based on crystallographic, ligand-binding and molecular modeling studies of two glycolytic glycosomal enzymes from T. brucei. As the target for new drugs is the glycolysis pathway, which is present also in the human being, the new ligand must be selective. Fructose-1,6-bisphosphate aldolase (ALDO) is one of the target protein for the rational drug design. The structural analysis and crystallographic studies of ALDO from T. brucei have been done, from overexpressed protein. Several possible sites for selective inhibitor were found in T. brucei ALDO when compared with the three human isoenzyme sequences, based on the human ALDO A structure. The flexible C-terminal arm is a promising target for selective compounds, due to the non-conserved sequence. Crystals were grown, and X-ray diffraction was obtained up to 3.0Å, but still the crystals are small and show radiation damage. Triosephosphate isomerase (TIM) is the other target protein analyzed in this work. The structure of TIM from T. brucei is already known at high resolution. Crystals from overexpressed protein were obtained after extensive experiments. It was identified that the use of fresh protein is essential to grow good diffracting crystals. After obtaining crystals from overexpressed protein, it has been done soaking of new inhibitors, diffraction data collection and analysis of the structures of the possible complexes. The well known flexible loop in TIM closes upon the binding of either the substrate or an inhibitor analogue to the substrate in the active site. Rational drug design has been followed based on the "closed" conformation of the flexible loop. Nevertheless, with a new complex structure, in which the flexible loop adopts the "open" conformation, it has been done a search for new compounds in the database, non-derived from phosphate and phosphonate, through the program DOCK. Based on this procedure it was proposed new lead compounds which will be used on the rational drug design cycle. The structure of the thermostable triosephosphate isomerase from Bacillus stearothermophilus in complex with the competitive inhibitor 2PG was determined by X-ray crystallography to a resolution of 2.8Å. The structure was solved by molecular replacement using XPLOR. Two fold averaging and solvent flattening were applied to improve the quality of the map. Both of the active sites were occupied by the inhibitor and the flexible loop adopts the "close" conformation in both subunits. The crystallographic R-factor is 17.6% with good geometry. Bacillus stearothermophilus is considered a moderate thermophile organism. There are already five triosephosphate isomerase structures available from mesophilic organisms. The structure reported here is the first thermostable TIM reported. It has been conducted in this work a comparison between the thermophilic and the mesophilic protein structures available. Several reports had listed thermostable factors, which have been analyzed in all TIM structures available, from which it has been concluded that the hydrophobic interaction upon the dimmer formation and the higher number of proline residues are the most important factors that contribute to the thermostability of B. stearothermophilus TIM. Also it has been concluded that the ratio Arg/(Arg+Lys) is increased in B. stearothermophilus TIM more due to lower number of lysine instead of a higher number of arginine residues. Arginines have been analyze in B. s,tearothermophillis TIM as well as the interactions of arginines and lysines in all other TIM structures and it has not been possible to relate the increased ratio Arg/(Arg+Lys) with thermo stability, which was previously reported as important in thermostability
 
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Data de Publicação
2013-12-09
 
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