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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.76.2013.tde-17042013-114150
Document
Auteur
Nom complet
Vitor Carlos Coletta
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Carlos, 2013
Directeur
Jury
Guimarães, Francisco Eduardo Gontijo (Président)
Goncalves, Debora
Rezende, Camila Alves de
Titre en portugais
Estudo de pré-tratamentos da biomassa e da interação enzimática por meio de técnicas espectroscópicas e de microscopia óptica de alta resolução
Mots-clés en portugais
Bagaço de cana-de-açúcar
Enzimas
Fluorescência
Microscopia
Pré-tratamentos
Resumé en portugais
Neste trabalho, foram utilizadas metodologias ópticas para estudo da interação enzimática e de pré-tratamentos da biomassa. Mudanças de carga em fibras de polpa de eucalipto foram estudadas utilizando-se uma porfirina como sonda, uma vez que influenciam na interação enzimática. Foi investigada também a influência do caráter de carga na interação com a safranina, utilizada como marcador de celulose. Estudamos o efeito do pH na interação da enzima Celobiohidrolase Cel7A (CBH I) e de seus domínios separadamente com as fibras de eucalipto por meio do método de arraste, que se baseia na centrifugação da solução dos interagentes e na análise espectroscópica do sobrenadante. Essa interação também foi estudada por microscopia de fluorescência confocal utilizando-se fluoresceína como marcador para as enzimas. Outro objetivo do trabalho foi aplicar a microscopia confocal e a microscopia de imagem de tempo de vida da fluorescência (FLIM),com excitação por um e por dois fótons, para estudar a atuação de um pré-tratamento em bagaço de cana-de-açúcar. Esse pré-tratamento teve duas etapas: a primeira com ácido e a segunda com base.Os resultados para a interação da CBH I com as fibras de eucalipto mostram que esta é influenciada por mudanças de carga tanto no módulo de ligação à celulose (CBM) quanto no domínio catalítico. Imagens espectrais de microscopia confocal indicam a presença da enzima em interstícios ao longo de toda a parede da fibra. Nas amostras de bagaço, há uma forte correlação entre os tempos de decaimento da fluorescência da lignina e sua concentração. Uma não homogeneidade nas características de fluorescência ao longo da parede celular revela domínios de níveis distintos de agregação da lignina. O pré-tratamento ácido desordena a lignina e a acumula na borda externa da parede celular. O pré-tratamento alcalino remove eficientemente a lignina do centro da parede celular, mas não é tão eficiente próximo à superfície. Uma variedade complementar de estados foi acessada pela excitação por dois fótons. Uma estreita banda de emissão e tempos longos de decaimento sugerem que no bagaço não tratado a lignina é organizada de maneira que haja uma fraca interação entre as moléculas.
Titre en anglais
Study of pretreatments of biomass and enzymatic interaction by spectroscopic techniques and high resolution optical microscopy
Mots-clés en anglais
Enzymes
Fluorescence
Microscopy
Pretreatments
Sugarcane bagasse
Resumé en anglais
Optical methodologies were used for the study of the enzymatic interaction and pretreatments of biomass. Changes of charge on eucalyptus pulp fibers were studied with the use of a porphyrin as a probe, since these changes influence on the enzymatic interaction. The influence of the charge character was also investigated for the interaction with safranin, used as cellulose labeling. We studied the pH effect on the interaction of the enzyme Cellobiohydrolase Cel7A (CBH I) and its domains separately with eucalyptus pulp fibers by the drag method, which is based on the centrifugation of the enzymes solution with the fibers and on the spectroscopic analysis of the supernatant. This interaction was also studied by confocal fluorescence microscopy with the use of fluorescein as a labeling for the enzymes. Another objective was the application of confocal microscopy and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), both with single-photon and two-photon excitation, in the study of a pretreatment applied in sugarcane bagasse. This pretreatment had two steps: the first one with acid and the second one with alkali. The results for the interaction between CBH I and the eucalyptus fibers show that it is influenced by changes of charge both in cellulose-binding module (CBM) and in the catalytic domain. Spectral confocal images indicate the presence of enzymes along all the cell wall. Regarding the bagasse fibers, a strong correlation was observed between the fluorescence decay time and the delignification. A non-homogeneity of the fluorescence properties along the cell wall reveal domains of lignin with different aggregation levels. The acid pretreatment disorders lignin and accumulate it on the external border of the cell wall. The alkali pretreatment removes lignin from the center of the cell wall efficiently, but it is not so effective close to the surface. A complementary variety of states was accessed by two-photon excitation. A narrow emission band and slow decay times suggest that lignin is organized in such a way that the interaction between the molecules is weak.
 
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Date de Publication
2013-04-22
 
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