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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.76.1996.tde-20022014-171213
Document
Author
Full name
Maria Teresa da Silva
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Carlos, 1996
Supervisor
Committee
Garratt, Richard Charles (President)
Arni, Raghuvir Krishnaswamy
Oliva, Glaucius
Sanches, Rosemary
Ward, Richard
Title in Portuguese
Estrutura cristalográfica da bothropstoxina-I, uma miotoxina k49 tipo fosfolipase A2
Keywords in Portuguese
Bothropstoxina-I (BthTX-I)
Difração de raios-x
Fosfolipase A2
Miotoxina
Abstract in Portuguese
A bothropstoxina I (BthTX-I) é uma miotoxina isolada do veneno da serpente brasileira Bothrops jararacussu, a qual é um membro da família das fosfolipases A2, mas não apresentam atividade catalítica devido á substituição D49K. A proteína for fornecida pelo Prof. Dr. J. R. Giglio e Profa. Dra. A. C. O. Cintra do Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e usada em experimentos de cristalização, os quais foram realizados usando a técnica de difusão de vapor "hanging drop" a 18°C. A BthTX-I cristalizou em tampão HEPES 0.1 M, pH variando entre 7.0 e 7.6. O agente precipitante foi o (NH4)SO4 em concentrações que variaram de 57% a 62% de saturação. A coleta de dados foi inicialmente feita utilizando o difratômetro automático R-AXIS IIC da Rigaku Co. do Laboratório de Cristalografia de proteínas do IFSC-USP. Subseqüentemente foi realizado uma segunda coleta de dados no SERC Daresbury Laboratory na Inglaterra, usando radiação síncrotron. A BthTX-I cristalizou no grupo espacial P3121 com os seguintes parâmetros de rede: a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. O processamento de dados foi realizado com o programa MOSFLM, conduzindo a um Rmerge=6.3% e completeza de 99.6% a uma resolução de 2.1 ANGSTROM. A estrutura foi resolvida por Substituição Molecular, utilizando o programa AMoRe, onde foi utilizada como modelo inicial a estrutura da miotoxina da serpente Agkistrodon piscivorus piscivorus e refinada usando o programa XPLOR que conduziu a um fator Rfinal= 18.7% e Rfree=27.4%. A unidade assimétrica contém dois monômeros, os quais podem ser escolhidos de forma a apresentar interações similares aquelas descritas para a miotoxina II da Bothrops asper. A superfície de interface é entretanto, surpreendentemente pequena quando comparada com outras estruturas diméricas e a complementaridade é menor do que o valor esperado. Um modelo teórico para a ligação do fosfolipídeo na BthTX-I sugere que nenhuma interação direta entre a ligação ester sn-2 e a K49 deve ser esperada de forma a explicar a falta de atividade catalítica. Foi visto também, que é possível se reproduzir um dendrograma baseado na seqüência de aminoácidos, pelo uso de estruturas tridimensionais para os membros da família das PLA2
Title in English
Crystal Structure of Bothropstoxin-I, a K49 type myotoxic phospholipase A2
Keywords in English
Bothropstoxin-I (BthTX-I)
Myotoxin
Phospholipase A2
X-ray diffraction
Abstract in English
Bothropstoxin- I (BthTX-I) is a myotoxin isolated from the Brazilian snake Bothrops jararacussu which is a member of the phospholipase A2 but presents no catalytic activity due to a D49K substitution. Protein was provided from the Departamento de Medecina de Ribeirão Preto by Prof. Dr. J. R. Giglio and Profa. Dra. A. C. O. Cintra and used in crystallization experiments which were performed using the vapor diffusion technique in hanging drops at 18°C. The BthTX-I crystallized in 0.1 M HEPES, pH ranging from 7.0 to 7.6. The precipitant was (NH4)SO4 in concentrations ranging from 57% to 62%. The data collection was initially performed using the automatic difractometer R-AXIS IIC from the Rigaku Co. at the Laboratório de Cristalografia of IFSC-USP. Subsequently a second data set was collected at SERC Daresbury Laboratory in England using synchrotron radiation. BthTX-I crystallizes in space group P3121 with a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. Processing of the data was performed with the MOSFLM program yielding an Rmerge= 6.3% and completeness of 99.6% at 2.1 ANGSTROM. resolution. The structure was solved by Molecular Replacement using the package AMoRe with the Agkistrodon piscivorus piscivorus enzyme as search model and refined using the refinement program X-PLOR to a Rfinal= 18.7% and Rfree=27.4%. The asymmetric unit contains two BthTX-I monomers, which can be chosen such that they present similar interactions to those described for the homologous myotoxin II from Bothrops asper. The interface is, however, surprisingly small when compared to other dimeric structures and is less complementary than expected. A theorical model for phospholipid building to BthTX-I suggests that no direct interactions between the sn-2 ester bond and K49 would be expected, thus explaining the lack of catalytic activity. It is shown that it is possible to reproduce a dendrogram based on amino acid sequences and by the use of three dimensional structures for members of the PLA2 family
 
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MariaTerezaGiottoD.pdf (18.55 Mbytes)
Publishing Date
2014-02-21
 
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