• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.76.2010.tde-28092010-155704
Document
Author
Full name
Joci Neuby Alves Macêdo
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Carlos, 2010
Supervisor
Committee
Garratt, Richard Charles (President)
Bertolini, Maria Celia
Franco, Glória Regina
Kobarg, Jorg
Marco, Ricardo De
Title in Portuguese
Estudos estruturais e funcionais de septinas humanas: a ligação e hidrólise de GTP por SEPT3 e a busca de parceiros funcionais de SEPT1, SEPT5 e SEPT7
Keywords in Portuguese
Atividade GTPásica
Septinas
Sistema do duplo híbrido em leveduras
Abstract in Portuguese
Septinas são proteínas que pertencem a super família das GTPases e que foram inicialmente identificadas em Saccharomyces cerevisae, mas logo em seguida, também em eucariotos superiores, exceto em plantas. Estas proteínas estão envolvidas em uma variedade de processos celulares tais como segregação de cromossomos, polaridade celular, dinâmica da membrana, tráfego de vesículas, exocitose, apoptose, entre outros. Mutações ou alterações no padrão de expressão de septinas são associadas com vários cânceres e doenças neurológicas. Objetivando contribuir com informações funcionais sobre tais proteínas, as septinas humanas 1, 5 e 7 foram usadas como iscas em ensaios de duplo híbrido em leveduras visando à identificação de seus parceiros protéicos. Após a varredura de bibliotecas de cDNA de leucócitos e cérebro fetal humano, os parceiros protéicos predominantemente encontrados foram outras septinas de grupos diferentes aos das iscas. As interações septina-septina envolveram o domínio de ligação a GTP. Ainda, outros parceiros, diferentes de septinas, foram também identificados nas bibliotecas e estes se mostraram funcionalmente relacionados à endocitose, à regulação da atividade de GTPases, ao tráfego intracelular, aos ciclos de sumoilação, à manutenção da placa metafásica e à maturação do centrossomo. Algumas destas funções são inéditas e foram pela primeira vez relacionadas às septinas. Este trabalho também esteve voltado à caracterização biofísica das septinas 3 e 5 (SEPT3 e SEPT5). Muitos protocolos diferentes foram desenvolvidos na tentativa de obter amostras homogêneas de SEPT5, mas não foram bem sucedidos. Por outro lado, SEPT3 recombinante, destituída do domínio amino-terminal (SEPT3GC) foi eficientemente produzida em E. coli. O estado monomérico de SEPT3GC em solução foi confirmado por cromatografia de exclusão molecular e espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS). SEPT3GC mostrou-se ativa e capaz de hidrolizar GTP in vitro. A afinidade de SEPT3GC por GTPγS e GDP foi avaliada por calorimetria de titulação isotérmica (ITC), sendo que o KD de SEPT3GC para GTPγS foi de 5,43 μM e a ligação para este nucleotídeo foi dependente de Mg2+. A ligação para GDP não foi detectável. Agregados de SEPT3GC induzidos por temperatura foram capazes de ligar a sonda fluorescente tioflavina-T, sugerindo uma natureza amilóide para tais estruturas.
Title in English
Functional and structural studies of human septins: GTP hydrolyse and binding, and screening of functional partners to SEPT1, SEPT5 e SEPT7
Keywords in English
GTPase activity
Septins
Yeast two hybrid system
Abstract in English
Septins are proteins that belong to the superfamily of GTPases, which were initially identified in Saccharomyces cerevisiae, and then in higher eukaryotes, except plants. These proteins are involved in a variety of cellular processes such as chromosome segregation, cell polarity, membrane dynamics, vesicle trafficking, exocytosis, apoptosis, among others. Mutations or changes in the expression of septins have been associated with various cancers and neurological diseases. Aiming to provide functional information about these proteins, the human septins 1, 5 and 7 were used as baits in yeast two-hybrid assay in order to identify their protein partners. After screening cDNA libraries from human leukocytes and fetal brain, the protein partners predominantly found were septins from others groups. The septin-septin interactions involved the GTP binding domain. Others non-septins interactors have also been identified in the libraries and were functionally related to endocytosis, the regulation of the GTPase activity, intracellular trafficking, sumoylation, maintenance of metaphase plate and centrosome maturation. Some of these functions are new and were related to the septins for the first time. This work also focused on the biophysical characterization of the septins 3 and 5 (SEPT3 and SEPT5). Many different protocols were developed aiming to obtain homogeneous samples of SEPT5, but were not successful. On the other hand, recombinant SEPT3, without the amino-terminal domain (SEPT3GC), was produced in a homogeneous form in E. coli. SEPT3GC is monomeric in solution as confirmed by size exclusion chromatography and small-angle X-ray scattering (SAXS). Also, SEPT3GC has shown to be active and able to hydrolyze GTP in vitro. The SEPT3GC affinity by GTPγS and GDP were evaluated by isothermal titration calorimetry (ITC). The KD for GTPγS was about 5,43 μM and it was observed to be Mg2+ dependent. The binding to GDP was not detectable. SEPT3GC aggregates induced by temperature were able to bind the thioflavin-T fluorescent probe, suggesting an amyloid nature for such structures.
 
WARNING - Viewing this document is conditioned on your acceptance of the following terms of use:
This document is only for private use for research and teaching activities. Reproduction for commercial use is forbidden. This rights cover the whole data about this document as well as its contents. Any uses or copies of this document in whole or in part must include the author's name.
Publishing Date
2010-10-20
 
WARNING: Learn what derived works are clicking here.
All rights of the thesis/dissertation are from the authors
Centro de Informática de São Carlos
Digital Library of Theses and Dissertations of USP. Copyright © 2001-2020. All rights reserved.