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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.76.2007.tde-29032007-121740
Document
Author
Full name
Leandro Seiji Goto
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Carlos, 2007
Supervisor
Committee
Araujo, Ana Paula Ulian de (President)
Goldman, Maria Helena de Souza
Oliva, Maria Luiza Vilela
Oliveira Junior, Osvaldo Novais de
Thiemann, Otavio Henrique
Title in Portuguese
"Estudos estruturais e funcionais sobre duas lectinas: cadeia B recombinante da pulchellina & Camptosemina"
Keywords in Portuguese
Camptosemina
Lectinas vegetais
Pulchellina
Abstract in Portuguese
Lectinas estão situadas dentro de um grupo estruturalmente diverso de proteínas que se ligam a carboidratos e glicoconjugados com grande especificidade. Encontradas em diversos organismos, elas são moléculas extremamente úteis na caracterização de sacarídeos, como agentes mediadores de endereçamento de fármacos ou até mesmo como marcadores de superfície celular. A pulchellina é uma glicoproteína heterodimérica ligante de D-Galactose oriunda de sementes de Abrus pulchellus e classificada como proteína inativadora de ribossomo do tipo 2 (“type 2 ribosome-inactivating protein” - type 2 RIP). A cadeia B recombinante da pulchellina (rPBC) foi previamente produzida em E. coli BL21(DE3). Neste presente trabalho, a rPBC é analisada quanto a sua atividade, interação com células de mamíferos “in vitro” e estabilidade estrutural. Os resultados indicam que a rPBC possui seletividade quanto a tipos celulares alvo e é endocitada ativamente, provavelmente compartilhando a via de endocitose descrita para outras RIPs. Além disto, a rPBC foi unida à cadeia catalítica e o heterodímero resultante demonstrou toxicidade similar à da holotoxina nativa, confirmando a atividade da rPBC e atribuindo-lhe papel essencial no mecanismo de intoxicação. Uma segunda parte deste trabalho tratou de outra lectina, extraída de sementes de Camptosema ellipticum. Recentemente, experimentos com extratos aquosos obtidos a partir de sementes de Camptosema ellipticum demonstraram possuir atividade hemaglutinante frente a hemácias humanas. Tal atividade foi atribuída a um dado componente protéico que foi então purificado através de cromatografias de troca iônica e exclusão molecular. A proteína, então chamada camptosemina, demonstrou ocorrer na forma de um tetrâmero e cujo estado de oligomerização pode ser controlado pelo pH do meio. Informações sobre a seqüência primária na porção amino-terminal, obtidas por seqüenciamento de aminoácidos, permitiram o desenho de oligonucleotídeos degenerados para a amplificação e clonagem de seu cDNA. As seqüências dos clones obtidos foram submetidas a diversas rotinas de procura de dados do NCBI. Entre os resultados retornados encontraram-se a concanavalina e a aglutinina de amendoim, dois representantes da chamada família de lectinas de leguminosas. Representantes deste grupo compartilham com a camptosemina o tamanho de seus monômeros e a forma de controle de seus graus de oligomerização. O presente trabalho traz a caracterização preliminar da camptosemina quanto a sua seqüência primária e oligomerização através de técnicas de clonagem e de espectroscopia. Foi possível a clonagem de duas variantes para o cDNA da camptosemina cujas seqüências prevêem um peptídeo sinal N-terminal ausente na proteína madura. As seqüências primárias deduzidas são muito semelhantes entre si e em comparação com outros membros da família de lectinas de leguminosas. A camptosemina se demonstrou extremamente resistente a mudanças de temperatura, exibindo sua dissociação em monômeros somente sob pHs extremamente ácidos ou alcalinos.
Title in English
"Structural and functional studies on two lectins: recombinant pulchellin B chain and camptosemin"
Keywords in English
Camptosemin
Plant lectins
Pulchellin
Abstract in English
Lectins have been placed in a structurally diverse group of proteins that bind carbohydrates and glycoconjugates with high specificity. Found in several organisms, they are extremely useful molecules in the characterization of saccharides, as drug delivery mediators, and even as cellular surface markers. Pulchellin is a D-Galactose-binding heterodimeric glycoprotein from Abrus pulchellus seeds and classified as a type-2 ribosome-inactivating protein (type-2 RIP). The recombinant pulchellin B (rPBC) was previously produced in E. coli BL21 (DE3). In the present work, rPBC is analyzed with respect to its interaction with mammal cells “in vitro” and structural stability. Results show that rPBC has selectivity for targeted cell types and that it is actively endocytosed, probably by the same route described for other RIPs. Furthermore, rPBC was bond to the catalytic chain and the resulting heterodimer has shown toxicity degree very similar to the native holotoxin, confirming rPBC activity and attributing it a essential role in the intoxication mechanism. A second part of this work has dealed with another lectin extracted from the seeds of Camptosema ellipticum. Recently, experiments with water-soluble extracts obtained from the seed of Camptosema ellipticum have shown to have hemagglutinative properties when assayed with human erythrocytes. Such biological activity was attributed to a certain proteic component that was purified by ion-exchange and size-exclusion chromatographies. The protein, so called camptosemin, has shown to occur as a tetramer and which oligomerization’s state could be driven by the environmental pH. Primary sequence information from the amino-terminal portion, obtained by aminoacid sequencing, allowed the design of degenerated oligonucleotides for the amplification and cloning of its cDNA. The obtained clones’ sequences were submitted to several NCBI data bank search scripts. Among the retrieved results were found concanavalin and peanut agglutinin, two representatives of the called legume lectins family. Members of this group share with camptosemin their monomer sizes and the way their oligomerization state can be driven. This present work characterizes camptosemin with respect to its sequence and oligomerization using cloning and spectroscopy techniques. It was possible the cloning of two cDNA variants for camptosemin which sequences deduce an N-terminal signal peptide absent in the mature protein. Deduced primary sequences are very similar to each other and to other legume lectin members. Camptosemin has shown being extremely temperature resistant, only dissociating in monomeric subunits under extremely acid or alkaline pHs.
 
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TESE_Final.pdf (10.91 Mbytes)
Publishing Date
2007-04-20
 
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