Devido a crescente onda de resistência bacteriana a nível global, a Organização Mundial da Saúde classificou grupos de bactérias multidroga resistentes quanto à prioridade para a pesquisa e desenvolvimento de novos antibióticos, dentre os quais Enterococcus faecium resistentes à vancomicina (VRE) se encontra classificado como alta prioridade. Entre as opções terapêuticas de último recurso para combater infecções causadas por VRE está daptomicina (DAP), no entanto, a resistência a este antibiótico em VRE já foi relatada. Recentemente, pesquisadores do IFSC-USP detectaram que uma mutação no gene lafB de E. faecium causou hipersensibilidade a DAP. O gene lafB codifica a glicosiltransferase LafB, envolvida na via de formação da âncora do ácido lipoteicóico (LTA), que também está presente em outras bactérias gram-positivas como Listeria monocytogenes e Enterococcus faecalis. Deste modo, este trabalho procurou verificar o papel da mutação do gene lafB no fenótipo bacteriano, caracterizar biofisicamente a proteína, e estudar in-silico uma predição da estrutura tridimensional da LafB, pois é um alvo promissor para aumentar a atividade da DAP em bactérias gram-positivas. Para isso, foi feita uma comparação entre as linhagens de HBSJRP 18_2.1 (supersensível a DAP) e HBSJRP 18_2.7 (sensibilidade normal a DAP) acerca do crescimento bacteriano, perfil metabólico, capacidade de formação de biofilme e virulência in-vivo em modelo de Galleria mellonella. A mutação em lafB causou uma significativa queda no crescimento bacteriano e virulência da linhagem supersensível, porém, não apresentou diferença significativa na capacidade de formação de biofilme, nem nas condições metabólicas analisadas. Concomitantemente, foi feita a clonagem, expressão e purificação por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular da proteína LafB nativa e mutada. Ao contrário da LafB nativa, a proteína mutada é insolúvel nos passos de purificação nas mesmas condições de tampão e temperatura. Com amostras purificadas da proteína LafB nativa, se realizaram ensaios de dicroísmo circular e SEC-MALS. Sob condições in-vitro, LafB é monomérica, possui uma massa molecular de 41.76 kDa, temperatura de Melting de 37 °C, e possui estruturas secundárias -helicoidais. Para a análise in-silico, a estrutura tridimensional da proteína foi predita usando o software AlphaFold, adicionalmente, foi feito um acoplamento entre a estrutura predita da proteína e o ligante hipotético UDP-galactose. Os resultados sugerem que estruturalmente a LafB pertence às glicosiltransferases da família GTB, e que devido ao fato de a mutação estar próxima ao suposto sítio catalítico, é provável que as mudanças nas interações que ocorrem entre os aminoácidos da proteína e ligante, sejam a causa das mudanças observadas no fenótipo da linhagem mutada. No futuro, testes com diferentes condições de purificação serão feitos para estabilizar e cristalizar a proteína para resolver sua estrutura tridimensional, a fim de entender mais a fundo o papel da proteína LafB na sensibilidade a daptomicina.

Given the globally rising wave of bacterial resistance, the World Health Organization has classified groups of multidrug-resistant bacteria as a priority to research and develop new antibiotics, including vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VRE) classified as a high priority microorganism. Among the therapeutic options of last resort to combat infections caused by VRE is daptomycin (DAP). However, the DAP resistance in VRE has already been reported. Recently, researchers at IFSC-USP detected that a mutation in the E. faecium lafB gene caused hypersusceptibility to DAP. The lafB gene encodes the LafB glycosyltransferase, involved in the lipoteichoic acid (LTA) anchor synthesis pathway, which is also present in other Gram-positive bacteria, such as Listeria monocytogenes and Enterococcus faecalis. Therefore, this work aimed to verify the lafB gene mutation role in the bacterial phenotype, characterize the LafB protein biophysically, and study in-silico a prediction of the threedimensional structure of LafB, because it is a promising target to increase the DAP activity in Gram-positive bacteria. For this purpose, a comparison between HBSJRP 18_2.1 (supersensitive to DAP) and HBSJRP 18_2.7 (normal sensitivity to DAP) strains was performed by observing bacterial growth and metabolite profile, biofilm-forming ability, and in-vivo virulence in a Galleria mellonella model. The mutation caused a significant decrease in bacterial growth and virulence of the supersensitive strain, but the strains showed no significant differences in biofilm-forming ability nor marked differences in the metabolic profile analyzed. Concurrently, the lafB gene was cloned, expressed, and LafB was purified by affinity chromatography and molecular exclusion chromatography. Unlike the native LafB, the mutated protein is insoluble under the same buffer and temperature conditions during the purification steps. Circular dichroism and SEC-MALS assays were performed with purified native LafB protein. Under in-vitro conditions, LafB is monomeric, has a molecular mass of 41.76 kDa, melting temperature of 37 °C, and -helicoidal secondary structures. For the in-silico analysis, the protein's three-dimensional structure was predicted using AlphaFold software. Additionally, a coupling between the protein predicted structure and UDP-galactose, as a hypothetical ligand, was performed. The results suggest that structurally LafB would belong to the GT-B family of glycosyltransferases. Because the mutation is close to the putative catalytic site, changes in the protein amino acids and the ligand interactions are likely the causes of the changes observed in the phenotype of the mutated strain. In the future, tests with different purification conditions will be performed to stabilize and crystallize the protein to resolve its three-dimensional structure to understand further the LafB protein's role in daptomycin susceptibility.