This work presents the biochemical characterization of relevant CAZymes from Thermothelomyces thermophilus M77, which includes a cellobiose dehydrogenase (TthCDHIIa), an endoglucanase (TthCel7B), and cellobiohydrolases (TthCel7A and TthCel6A). Furthermore, it explores their application as antimicrobial and antibiofilm agents. In the first part of this study, it was demonstrated that TthCDHIIa is thermostable in different ionic solutions and is capable of oxidizing multiple mono and oligosaccharide substrates and to continuously produce H₂O₂. Kinetics measurements depict the enzyme catalytic characteristics consistent with an Ascomycota class II CDH. Our structural analyses show that TthCDHIIa substrate binding pocket is spacious enough to accommodate larger cello and xylooligosaccharides. We also reveal that TthCDHIIa supplemented with cellobiose reduces the viability of Staphylococcus. aureus ATCC 25923 up to 32% in a planktonic growth model and inhibits its biofilm growth on 62.5%. Furthermore, TthCDHIIa eradicates preformed S. aureus biofilms via H₂O₂ oxidative degradation of the biofilm matrix, making these bacteria considerably more susceptible to gentamicin and tetracycline. In the second part of this study, the investigated cellulases exhibited a preference for acidic conditions and high temperatures in the hydrolysis of substrates. Additionally, we described the functionality of the carbohydratebinding module. The structural characteristics of cellobiohydrolases and endoglucanases, such as the loop arrangement, aligned with the type of recognized substrate. The optimization of the mixture of TthCel7A, TthCel7B, and TthCel6A using a Simplex-lattice design model revealed that for a higher degradation of Gluconoacetobacter hansenii BC, a 49.3% TthCel7A and 50.7% TthCel6A enzymatic load is required. To achieve optimal degradation of a pathogenic model and a clinical Escherichia coli biofilm, binary mixtures comprising 56.5% TthCel7B + 43.5% TthCel6A and 59.6% TthCel7A + 40.4% TthCel7B were found to be effective, respectively. This optimization resulted in a reduction in the quantity of enzymes required for biofilm eradication, with EC₅₀ values of 0.086 μM and 0.63 μM for the hydrolysis of clinical and pathogenic E. coli, respectively. Confocal laser scanning microscopy demonstrated changes in protein and carbohydrate content under cellulase treatment. Notably, TthCel7B played a key role as a potent eradication agent, particularly since extracted cellulose from E. coli biofilms is amorphous. These findings provide valuable insights for the prospective use of endoglucanase enzymes in the treatment of biofilm-associated diseases. In summary, T. thermophilus emerges as a promising source of antibiofilm enzymes.

Este trabalho apresenta a caracterização bioquímica das CAZymes relevantes de Thermothelomyces thermophilus M77, que inclui uma celobiose desidrogenase (TthCDHIIa), uma endoglucanase (TthCel7B) e celobiohidrolases (TthCel7A e TthCel6A). Além disso, explora a sua aplicação como agentes antimicrobianos e antibiofilme. Na primeira parte deste estudo, foi demonstrado que a TthCDHIIa é termoestável em diferentes soluções iônicas e capaz de oxidar múltiplos mono e oligossacarídeos, produzindo continuamente H₂O₂. Medidas cinéticas retratam as características catalíticas da enzima consistentes com um CDH classe II de origem Ascomycota. Nossas análises estruturais revelam que o sítio de ligação do substrato do TthCDHIIa é espaçoso o suficiente para acomodar celooligossacarídeos e xilooligossacarídeos maiores. Também descobrimos que o TthCDHIIa suplementado com celobiose reduz a viabilidade do Staphylococcus aureus ATCC 25923 em até 32% em um modelo de crescimento planctônico e inibe o crescimento do seu biofilme em 62.5%. Além disso, o TthCDHIIa erradica biofilmes pré-formados do S. aureus por meio da degradação oxidativa da matriz do biofilme via H₂O₂, tornando essas bactérias consideravelmente mais suscetíveis à gentamicina e tetraciclina. Na segunda parte deste estudo, as celulases investigadas demonstraram preferência por condições ácidas e altas temperaturas na hidrólise dos substratos. Além disso, descrevemos a funcionalidade do módulo de ligação a carboidratos. As características estruturais das celobiohidrolases e endoglucanases, como a disposição dos loops, estão alinhadas com o tipo de substrato reconhecido. A otimização da mistura de TthCel7A, TthCel7B e TthCel6A usando o planejamento em rede Simplex revelou que, para uma maior degradação do Gluconoacetobacter hansenii cellulose, é necessária uma carga enzimática de 49.3% de TthCel7A e 50.7% de TthCel6A. Para atingir uma degradação ótima dos biofilmes de Escherichia coli patogênicos e clínicos, foram encontradas misturas binárias de 56.5% de TthCel7B + 43.5% de TthCel6A e 59.6% de TthCel7A + 40.4% de TthCel7B, respectivamente. Essa otimização resultou em uma redução na quantidade de enzimas necessárias para a erradicação de biofilmes, com valores de EC₅₀ de 0.086 μM e 0.63 μM para a hidrólise de E. coli clínica e patogênica, respectivamente. A microscopia confocal de varredura a laser demonstrou alterações no conteúdo de proteínas e carboidratos sob tratamento com celulase. Notavelmente, a TthCel7B desempenhou um papel fundamental como agente de erradicação potente, especialmente considerando que a celulose extraída dos biofilmes de E. coli é amorfa. Essas descobertas fornecem informações valiosas para o uso prospectivo de enzimas endoglucanase no tratamento de doenças associadas a biofilmes. Em resumo, T. thermophilus emerge como uma fonte promissora de enzimas antibiofilme.