O câncer é uma das doenças mais agressivas e mortais da atualidade. Em 2020 o câncer de mama matou cerca de 684 mil mulheres no mundo e em 2020 no Brasil, ocorreram 66 mil novos casos. Ensaios celulares apresentam grande relevância para a identificação de substância com novos mecanismos de ação ou na confirmação de um mecanismo. Neste estudo, novas substâncias bioativas com atividade antineoplásica foram testadas em modelos celulares, inclusive com análise de terapia combinada, uma vez que estudos prévios demonstraram uma combinação (Neq 0780 e doxorrubicina) com elevada sinergia. As substâncias analisadas são inibidoras de cisteíno proteases, e se mostraram não citotóxicas para as linhagens de câncer responsivas ao hormônio feminino (estradiol MCF-7) e independente (MDA-MB-231), além da linhagem não tumoral BALB/3T3 clone A31. O ensaio de fechamento da risca não mostrou atividade antimigratória significativa para a linhagem testada (MDA-MB-231) quando comparado às células sem tratamento, no entanto, no ensaio de terapia combinada foi possível identificar sinergia em todas as amostras testadas nessa linhagem, com resultados promissores para o Neq1008, que potencializou quinze vezes mais o agente citotóxico. A terapia combinada aplicada ao fibroblasto de camundongo (controle) revelou antagonismo em treze das quinze amostras testadas e destacou seletividade quando comparado a linhagem tumoral MDA-MB- 231, sugerindo menores efeitos colaterais com a combinação doxorrubicina e derivado de dipeptidil nitrila. Com o ensaio de Espécie Reativa de Oxigênio, foi possível avaliar maior expressividade de ROS enquanto terapia combinada entre os compostos NEQUIMED e doxorrubicina se comparada à doxorrubicina isolada. Por fim, com o ensaio de Western Blot foi possível avaliar a inibição das catepsinas B, L e S quando usados os novos compostos estudados se relacionado ao controle. Esses resultados incentivam análises mais detalhadas que possam explicar por quais mecanismos as combinações podem estar levando a morte celular.

Cancer is one of the most aggressive and deadly diseases of our time. In 2020, breast cancer claimed the lives of approximately 684,000 women worldwide, with 66,000 new cases occurring in Brazil. Cellular assays hold significant relevance for identifying substances with novel mechanisms of action or confirming existing ones. In this study, new bioactive substances with antineoplastic activity were tested using cellular models, including combined therapy analysis. Previous studies demonstrated high synergy with a combination (Neq0780 and doxorubicin), motivating the investigation. The analyzed substances are inhibitors of cysteine proteases and demonstrated non-cytotoxic effects on hormone-responsive (estradiol MCF-7) and hormone-independent (MDA-MB-231) breast cancer cell lines, as well as the non-tumoral BALB/3T3 clone A31. The scratch closure assay indicated no significant antimetastatic activity in the MDA-MB-231 cell line compared to untreated cells. However, the combined therapy assay identified synergy in all samples tested for this cell line, with promising results for Neq1008, which enhanced cytotoxicity by fifteenfold. Combined therapy on mouse fibroblasts (control) showed antagonism in thirteen out of fifteen tested samples, highlighting selectivity when compared to the MDA-MB-231 tumor line. This suggests reduced side effects with the combination of doxorubicin and dipeptidyl nitrile derivatives. Reactive Oxygen Species (ROS) assay revealed increased ROS expression in the combined therapy of NEQUIMED compounds and doxorubicin compared to doxorubicin alone. Finally, Western Blot analysis indicated the inhibition of cathepsins B, L, and S when using the new compounds, in relation to the control. These findings encourage more detailed analyses to elucidate the mechanisms underlying the cell death induced by these combinations.