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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.85.2009.tde-17112009-103750
Documento
Autor
Nome completo
Luis Claudio Suzuki
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2009
Orientador
Banca examinadora
Ribeiro, Martha Simões (Presidente)
Daghastanli, Nasser Ali
Junqueira, Juliana Campos
Título em português
Desenvolvimento de biofilme formado por Candida albicans in vitro para estudo do efeito fotodinâmico
Palavras-chave em português
Biofilme
Candida
OCT.
PDT
Resumo em português
A terapia fotodinâmica, do inglês photodynamic therapy (PDT) é uma fototerapia baseada na utilização de um fotossensibilizador (FS) na presença da luz em baixa intensidade em comprimento de onda ressonante à absorção do FS e que podem sensibilizar sistemas biológicos, gerando espécies reativas de oxigênio. Estudos mostram que a PDT apresenta um efeito letal em Candida albicans. O biofilme formado por C. albicans é a causa mais freqüente de infecções associadas a cateteres, possuindo uma comprovada resistência a antifúngicos, sendo que a remoção do cateter colonizado é quase sempre necessária. No entanto, poucos trabalhos na literatura relatam o comportamento e a resposta de C. albicans organizado em biofilme frente à PDT. Os objetivos deste trabalho foram desenvolver uma metodologia para formação in vitro de biofilme de C. albicans, verificar a sensibilidade do biofilme de C. albicans frente à terapia fotodinâmica antimicrobiana utilizando como FS o azul de metileno (AM) e a hipocrelina B:La+3 e analisar o biofilme através da Tomografia de Coerência Óptica (OCT) antes e depois da PDT. Para a formação do biofilme, foram confeccionados discos de silicone elastomérico oriundos de cateteres. Os fotossensibilizadores foram diluídos em solução de PBS, sendo que o AM teve duas concentrações diferentes testadas no biofilme: 100M e 1mM e a HBLa+3 somente uma de 10M. A irradiação de ambos os corantes com os microrganismos foi feita através de dois LEDs diferentes, um vermelho com = 630nm ± 20nm e outro azul com = 460nm ± 30nm. Foi realizada uma curva de fração de sobrevivência em função do tempo de irradiação de cada amostra com biofilme e de suspensão do microrganismo em formato de leveduras para verificar a susceptibilidade destes frente à PDT. As leveduras apresentaram 100% de redução em ambos os fotossensibilizadores, porém em tempos de irradiação diferentes (30s para a HBLa+3 e 6 min para o AM na concentração de 100M). Quando a terapia foi aplicada em biofilme, o AM em 100M não apresentou nenhuma redução significativa, enquanto que em concentração de 1mM houve redução de 100% após 6 min de irradiação. Já a HBLa+3 mostrou pouca redução em biofilme na concentração de 10M (menos de 1 log de redução. Concluímos que o microrganismo C. albicans se organizou em biofilme padronizado nos discos elastoméricos oriundos de cateteres e através do OCT, o biofilme medido apresentou 110m de espessura, informando uma mudança óptica ao ser submetido pela PDT com o AM 1mM.
Título em inglês
Candida albicans BIOFILM DEVELOPMENT IN VITRO FOR PHOTODYNAMIC THERAPY STUDY
Palavras-chave em inglês
Biofilme
Candida
OCT.
PDT
Resumo em inglês
Photodynamic therapy (PDT) is a phototherapy based on the use of a photosensitizer (PS) in the presence of low intensity light with resonant wavelength of absorption of the PS and biological systems that can raise awareness, generating reactive oxygen species. Studies show that PDT has a lethal effect on Candida albicans. The biofilm formed by C. albicans is the cause of infections associated with medical devices such as catheters, with a proven resistance to antifungal agents, and the removal of the catheter colonized almost always is necessary. However, few studies in literature report the behavior and response of biofilm organized by C. albicans against PDT. The aims of this study were to develop a methodology for in vitro biofilm formation of C. albicans, evaluate the sensitivity of the biofilm of C. albicans to antimicrobial photodynamic therapy using PS as the methylene blue (MB) and hypocrellin B: La+3 (HBLa+3) and analyze the biofilm by Optical Coherence Tomography (OCT). For biofilm formation, discs were made from elastomeric silicone catheters. The PS were dissolved in solution of PBS, and the MB had two different concentrations tested in the biofilm: 100M and 1mM; HBLa+3 only one of 10M. The irradiation of both dyes with the microorganism was done by two different LEDs, one with red emission at = 630nm ± 20nm and the other one blue emission at = 460nm ± 30nm. We performed a curve of survival fraction versus time of irradiation of each sample with biofilm and suspension of the microorganism in the yeast form to verify the susceptibility of the front PDT. The yeast showed 100% reduction using both PS, but at different times of irradiation (30s to HBLa+3 and 6 min for the MB at 100M). When the therapy was applied in biofilm, the MB 100M did not show any significant reduction, while at concentration of 1mM was reduced by 100% after 6 min of irradiation. The HBLa+3 biofilm group showed a lower reduction in the concentration of 10M in biofilm (less than 1 log reduction). OCT was performed for visualization and measurement of the thickness of the biofilm formed. The composition of the extracellular matrix of the biofilm polymer hindered the diffusion of PS inside, requiring higher concentrations of MB to disseminate it and to obtain satisfactory reduction for PDT. HBLa+3 group, in higher concentration, formed aggregates difficulting its use for PDT. We conclude that the organism C. albicans was organized in biofilms in a standardized way using elastomeric discs from catheters and the OCT showed that the biofilm measured 110m at thickness, showing an optical change when subjected to the PDT with MB 1mM.
 
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LuisClaudioSuzuki.pdf (517.02 Kbytes)
Data de Publicação
2009-12-01
 
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