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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.87.2019.tde-03122018-145726
Documento
Autor
Nome completo
Janaina Areias Paulela
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2018
Orientador
Banca examinadora
Barros, Mário Henrique de (Presidente)
Alcalde, Felipe Santiago Chambergo
Dias, Marcio Vinícius Bertacine
Fernandes, Andrea Balan
Ronsein, Graziella Eliza
Título em português
Caracterização de linhagens de saccharomyces cerevisiae deficientes na biossíntese da Coenzima Q.
Palavras-chave em português
Coenzima Q
COQ3.
COQ7
Mutagênese sítio-dirigida
Saccharomyces cerevisiae
Resumo em português
Coenzima Q (CoQ) é uma molécula de função essencial na transferência de elétrons da cadeia respiratória mitocondrial. Em Saccharomyces cerevisiae , a CoQ é constituída por um anel de benzeno associado a uma cadeia poliprenil, com 6 unidades de repetição, sendo por isso também denominada CoQ6 ou Q6. Ao todo já foram identificados treze genes (COQ1 COQ11, ARH1 e YAH1) nucleares necessários para biossíntese da CoQ. A maioria dos produtos Coq estão fisicamente associados em um complexo biossintético ancorado na membrana mitocondrial interna. Neste projeto, tentamos descrever resíduos relevantes de Coq3p e Coq7p aliando análises de bioinformática com testes fenotípicos para balizamento funcional. Coq7p é uma proteína com dois centros de ferro com íons carboxilato e catalisa a hidroxilação de demetoxi-Q6 (DMQ6). Neste estudo, indicamos um grupo de resíduos que modulam a atividade e a estabilidade de Coq7p: D53, R57, V111 e S114. Enquanto R57, V111 e S114 são resíduos muito conservados, V111 e S114 estão correlacionados em comunidades de coevolução. Aqui, demonstramos também que o duplo mutante S114A, V111G e o mutante S114E apresentam deficiência respiratória em temperatura não permissiva, além de acumularem o intermediário DMQ6 e sintetizarem baixas quantidades de Q6, concluindo assim que o fosmimético S114E inibe a atividade Coq7p. Dessa forma, propomos que a fosforilação do resíduo S114 promove o deslocamento de uma alça entre as hélices 2 e 3, afetando assim a atividade do centro catalítico Coq7p. Por sua vez, Coq3p atua como uma metiltransferase, catalisando diferentes passos durante a biossíntese da CoQ. Aqui, identificamos resíduos que colaboram para a atividade funcional de Coq3p: E123, S125, C131, G133, G134, H165, D203, E219, K258 e S262. Mutantes carregando as alterações E123A, H165A, D203A, E219A, K258A e S62A apresentam discreto crescimento respiratório e expressão de Coq3p similares à da linhagem selvagem, além de acumularem baixas quantidades de Q6. Enquanto C131, G133 e G134 são resíduos altamente conservados, localizados em uma alça no espaço entre fitas beta, no provável sítio ativo da proteína, mutantes C131A, G133A e G134A se superexpressos apresentam crescimento respiratório em meio contendo fonte de carbono não fermentável, além de acumularem Q6 compatíveis com os níveis de expressão proteica. Propomos assim um modelo para Coq3p, tendo os resíduos C131, G133 e G134 como centro catalítico de Coq3p.
Título em inglês
Characterization of saccharomyces cerevisiae strains deficient in the biosynthesis of Coenzyme Q.
Palavras-chave em inglês
Coenzyme Q
COQ3
COQ7
Saccharomyces cerevisiae
Site-directed mutagenesis
Resumo em inglês
Coenzyme Q (CoQ) is a molecule of essential function in the transfer of electrons of the mitochondrial respiratory chain. In saccharomyces cerevisiae , CoQ is constituted by a benzene ring associated with a polyprenyl chain with 6 repetition units, being therefore also denominated CoQ6 or Q6. Thirteen nuclear genes have already been identified (COQ1 COQ11, ARH1 and YAH1) required for coenzyme Q biosynthesis. Most of Coq products are physically associated in a biosynthetic complex anchored at the mitochondrial internal membrane. In this project, we identified Coq3p and Coq7p residues relevant for their respective role in CoQ synthesis combining bioinformatics analyzes with phenotypic tests for functional mapping. Coq7p is a carboxylate-bridged di-iron protein that catalyzes the hydroxylation of demetoxy-Q6 (DMQ6), the last monooxygenase step in the synthesis of CoQ. In this study, we found a group of residues that modulate the activity and stability of Coq7p: D53, R57, V111 and S114. While R57, V111 and S114 are highly conserved residues, V111 and S114 are correlated in communities of coevolution. We also demonstrate that the double mutant S114A, V111G and the mutant S114E have respiratory deficiency at non-permissive temperature, in addition to accumulating of the intermediate DMQ6 and low amounts of Q6, thus concluding that phosmimetic S114E inhibits the activity of Coq7p. Hence, we propose that the phosphorylation of S114 is required to move a loop between helices 2 and 3, thus affecting the activity of the catalytic center Coq7p. For its part, Coq3p acts as a methyltransferase, catalyzing different steps during biosynthesis of CoQ. Here we identified residues that collaborate for functional activity of Coq3p: E123, S125, C131, G133, G134, H165, D203, E219, K258 and S262. Mutants E123A, H165A, D203A, E219A, K258A and S62A, have mild respiratory growth, and expression of Coq3p levels similar to the wild strain, in addition to accumulating low amounts of Q6. While C131, G133, and G134 are residues highly conserved, located in a loop in the space between beta sheets, the overexpression of the mutants C131A, G133A and G134A present respiratory growth in medium containing non-fermentable carbon source, in addition to accumulate Q6 compatible with the levels of protein expression. We propose a model for Coq3p, with residues C131, G133 and G134 as part of Coq3p catalytic center.
 
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Data de Publicação
2019-01-03
 
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