O interesse em células de inseto para a produção de proteínas complexas se deve a sua maior facilidade de cultivo e ao padrão equivalente de glicosilação quando comparado aos sistemas com células de mamíferos. O objetivo deste trabalho foi identificar fatores que limitam ou inibem a produção da glicoproteína do vírus rábico (GPV) expressa na membrana citoplasmática de células de Drosophila melanogaster transfectadas, quando cultivadas em biorreator de bancada agitado e bubble-free, operado em modo descontínuo. Avaliaram-se as influências de oxigênio dissolvido (5 < pO₂ <80%), da glicose (1 < GLC₀ < 15g/L) e da glutamina (0.6 < GLN₀ < 7g/L). Essas variáveis afetaram de forma diferenciada o crescimento celular (produção de células e velocidades específicas-µ_X), o metabolismo celular (fatores de conversão - Y_X/GLC, Y_X/GLN, Y_LAC/GLC, Y_ALA/GLC, Y_NH4/GLN, Y_ALA/GLN), assim como a expressão da proteína recombinante (concentração, teor celular e produtividade). O aumento do pO₂ reduziu em 9 vezes o crescimento celular mas aumentou o teor celular de GPV em 1,4 vezes. Baixos valores de GLC₀ e GLN₀, claramente, limitaram o crescimento, de modo que incrementos na concentração desses substratos, até valores intermediários, aumentaram µ_X,MAX em 3 vezes e 2,5 vezes, respectivamente, e a produção de células em 11 vezes e 3 vezes, respectivamente. O teor celular de GPV máximo não foi afetado pela GLC, mas aumentou em 100% para valores de GLN₀ igual ou superiores a 3,5 g/L. As concentrações de lactato produzidas foram consideradas baixas (inferiores a 0,8 g/L) para exercer qualquer efeito de inibição sobre o crescimento ou a expressão da proteína. Por sua vez, as concentrações de amônio parecem inibir tanto a produção de GPV (NH₄⁺~50mg/L) quanto o crescimento celular (NH₄⁺~80mg/L). A condição de cultivo com de 30% de pO₂, 10 g/L de GLC₀ e 3,5 g/L de GLN₀ resultou nos maiores valores de produtividade (9,1 µg/L.h) e de concentração de GPV (1,2 mg/L). O metabolismo de GLC e GLN apresentou grande interdependência, com alterações em GLC₀ afetando o metabolismo de GLN e vice-versa. Assim, em condições de excesso de GLC₀, as células apresentaram um metabolismo mais ineficiente com reduções nos fatores Y_X/GLC (2,3 vezes) e Y_X/GLN (4,6 vezes) e maior geração de subprodutos, caracterizada por incrementos nos valores de Y_ALA/GLC (51%), Y_LAC/GLC (11%) e Y_NH4/GLN (15%). O metabolismo da GLN apresentou resposta característica de substrato em excesso para toda a faixa de valores ensaiada, com redução de 25 vezes no valor de Y_X/GLN e inesperadamente também uma redução na geração de subprodutos de 7 vezes para Y_NH4/GLN e 12 vezes para Y_ALA/GLN. O efeito sobre o metabolismo da GLC foi mais acentuado para valores mais elevados de GLN₀, com redução de 3,6 vezes para Y_X/GLC e incrementos de 70% para Y_ALA/GLC e para Y_LAC/GLC. Os resultados sugerem ainda que a célula utiliza duas vias para metabolizar a glutamina: glutaminólise, em condição de limitação em GLC; ou glutamato sintase - NADH-GOGAT, em condição de excesso em GLC. A célula demonstrou também capacidade de sintetizar GLN, a partir de amônio ou outros aminoácidos, quando atingiu concentrações abaixo de 50 mg/L.

The interest in using insect cells to produce complex proteins is due to its ease of cultivation and its glycosylation pattern equivalent to that of mammalian cells systems. The objective of this work was to identify the limiting or inhibiting factors for the production of a rabies virus glycoprotein (RVGP), expressed in the cytoplasmatic membrane of a transfected Drosophila melanogaster S2 cells, when cultivated in a bench stirred bubble-free bioreactor, in batch mode. The influence of dissolved oxygen (5 < pO₂ < 80%), of initial glucose concentration (1 < GLC₀ < 15 g/L) and of initial glutamine concentration (0.6 < GLN₀ < 7 g/L) was evaluated. These variables affected in a different way cell growth (cell production and specific growth rate - µ_X), cell metabolism (yield factors - Y_X/GLC, Y_X/GLN, Y_LAC/GLC, Y_ALA/GLC, Y_NH4/GLN and Y_ALA/GLN), as well as the recombinant protein expression (RVGP concentration, RVGP cell content and RVGP productivity). pO₂ increase reduced 9 times cell growth, but increased 1.4 times RVGP cell content. Low initial glucose and glutamine concentrations clearly limited the cell growth, in such a way that raising these substrates concentrations up to intermediate values, increased µ_X,MAX 3 times and 2.5 times, respectively, and increased cell production 11 times and 3 times, respectively. The maximum RVGP cell content was not affected by GLC₀, but improved 100% when GLN₀ was 3.5 g/L or higher. The concentrations of produced lactate were considered low (below 0.8 g/L) to cause any inhibition effect on growth or protein expression. On the other hand, ammonium concentrations seem to inhibit RVGP production (NH₄⁺~50 mg/L), as well as cell growth (NH₄⁺~80 mg/L). Maximum productivity values (9.1 µg/L.h) and RVGP concentration (1.2 mg/L) were attained for 30% pO₂, 10 g/L of GLC₀ and 3.5 g/L of GLN₀ run. The metabolism of GLC and GLN showed a great interdependence, with GLC₀ changes affecting the GLN metabolism, and viceversa. Thus, in glucose excess condition, cell metabolism was less efficient. This implied in reduction of yield factors - Y_X/GLC (2.3 times) e Y_X/GLN (4.6 times) - and in higher by-products generation, characterized by augmentation in Y_ALA/GLC (51%), Y_LAC/GLC (11%) and Y_NH4/GLN (15%). The glutamine metabolism showed a substrate excess response pattern to the whole range of concentration studied, with reduction of Y_X/GLN (25 times) and, unexpectedly, a reduction of by-products liberation - Y_NH4/GLN (7 times) and Y_ALA/GLN (12 times). The effect on glucose metabolism was more intense when the glutamine concentration was higher, showing a 3.6 times diminution Y_X/GLC and a 70% augmentation for Y_ALA/GLC and Y_LAC/GLC. The results suggest that cells metabolize glutamine through two different pathways glutaminolysis, under glucose limitation, or glutamate synthase - NADH-GOGAT, under glucose excess. The cell, proved also to be able to synthesize glutamine from ammonium or other amino acids, when it reached concentrations below 50 mg/L.