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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.9.2012.tde-11062013-110641
Documento
Autor
Nome completo
Vinicius Buccelli Ribeiro
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2012
Orientador
Banca examinadora
Destro, Maria Teresa (Presidente)
Franco, Bernadette Dora Gombossy de Melo
Martinez, Marina Baquerizo
Mayer, Marcia Pinto Alves
Severino, Patrícia
Título em português
Expressão gênica e potencial de virulência de Listeria monocytogenes isolada de casos clínicos e alimentos submetida a estresse osmótico
Palavras-chave em português
Expressão gênica
Listeria monocytogenes
Microarray
Virulência
Resumo em português
O controle de Listeria monocytogenes (Lm) nas plantas processadoras de alimentos é uma tarefa difícil, devido à sua capacidade em formar biofilmes e se adaptar às condições adversas do ambiente. A sobrevivência a altas concentrações de cloreto de sódio, além da multiplicação em temperaturas de refrigeração são outras duas importantes características de isolados de Lm, incluindo os dois sorotipos mais prevalentes da espécie (4b e 1/2a). Os objetivos deste estudo foram avaliar o comportamento de multiplicação, da expressão gênica global e da virulência dos dois principais sorotipos de Lm em ambientes de estresse encontrados por esses micro-organismos na indústria de alimentos. Para tanto, 22 cepas de Lm - 12 isoladas de casos clínicos (seis cepas sorotipo 4b e seis sorotipo 1/2a) e 10 isoladas de alimentos (seis sorotipo 4b e quatro sorotipo 1/2a) - além de uma cepa de Listeria monocytogenes Scott A e outra de Listeria innocua, foram inoculadas em caldo BHI com atividade de água (aw) 0,94 (11% NaCl) e incubadas a 4°C, 10°C e 25°C durante 73, 42 e 15 dias, respectivamente. A 4°C, a maior parte das cepas, tanto clínicas como de origem alimentar, conseguiu se manter viável ou ainda se multiplicar e aumentar até 2 log UFC/ml a partir da população inicial. Já a 10°C, a maioria das cepas conseguiu se multiplicar, porém diferenças significativas (p < 0,05) na duração da fase lag entre as cepas dos sorotipos 1/2a e 4b, independentemente da origem das mesmas, foram observadas (lag1/2a > lag4b). Diferenças estatísticas também foram observadas no que diz respeito às cepas de Lm sorotipo 4b, quando incubadas a 25°C em meio de cultura BHI com aw 0,94, apresentando maiores taxa de multiplicação e concentração populacional máxima (p < 0,05) em comparação às cepas de Lm sorotipo 1/2a submetidas às mesmas condições. Já com relação ao potencial de virulência das cepas, não foram detectadas diferenças estatísticas entre os sorotipos com relação a sua capacidade hemolítica, entretanto, a capacidade de invasão das cepas sorotipo 4b em células Caco-2 foi maior (p < 0,05) em comparação ao sorotipo 1/2a. Além disso, análises comparativas pré e pós-estresse osmótico confirmaram o aumento no potencial de invasão (p < 0,05) tanto das cepas sorotipo 1/2a, quanto 4b após o contato com elevadas concentrações de sal. O papel dos reguladores de transcrição Sigma B e PrfA na sobrevivência de Listeria monocytogenes, sob condição de estresse osmótico, também foi avaliado. Ensaios de microarray com cepas das linhagens I e II demonstraram maiores níveis de transcrição para 173 e 68 genes, respectivamente, na cepa selvagem quando comparada à cepa mutante ΔsigB, incluindo genes relacionados à virulência (internalinas), sobrevivência a condições de estresse e metabolismo. Os resultados obtidos confirmam a habilidade de cepas de Lm se manterem viáveis ou mesmo se multiplicarem em baixas temperaturas, bem como em ambientes com elevada pressão osmótica, independentemente do sorotipo ou origem, enfatizando a necessidade de tomada de medidas efetivas de controle desse patógeno pela indústria de alimentos uma vez que cepas de Lm podem, além de sobreviver às condições adversas, ter seu potencial de virulência aumentado. Os dados obtidos também indicam a necessidade de mais estudos de avaliação comportamental e viabilidade de Lm em ambientes com concentração de sal modificada, uma vez que a discussão sobre a diminuição nos teores de sal em alimentos vem ganhando importância mundialmente.
Título em inglês
Gene expression and virulence potential of Listeria monocytogenes isolated from clinical sources and food and submitted to osmotic stress
Palavras-chave em inglês
Gene expression
Listeria monocytogenes
Microarray
Virulence
Resumo em inglês
The control of Listeria monocytogenes (Lm) in food processing plants is difficult due to its ability to form biofilms and adapt to adverse environmental conditions. The survival at high concentrations of sodium chloride and growing at low temperatures are two other important features of Lm isolates, including the two most prevalent serotypes (1/2a and 4b). The objectives of this study were to evaluate the growing behavior, global gene expression profile and virulence potential of the two main serotypes of Lm under osmotic stress environments encountered by these microorganisms in the food industry. 22 Lm strains - 12 isolated from clinical cases (six strains serotype 4b and six serotype 1/2a) and 10 isolated from food (six serotype 4b and four serotype 1/2a) - plus one L. monocytogenes Scott A and one Listeria innocua were inoculated into BHI broth with water activity (aw) 0.94 (11% NaCl) and were incubated at 4°C, 10°C and 25°C during 73, 42 and 15 days respectively. At 4°C, the majority of strains both clinical and food were able to remain viable and to grow (up to 2 log CFU/ml). At 10°C, most strains could grow but significant differences (p < 0.05) on the lag phase duration between the serotypes 1/2a and 4b strains, regardless their origin, were observed (lag1/2a > lag4b). Statistical differences were also observed related to Lm serotype 4b strains when grown in BHI with aw 0.94 at 25°C, that showed higher maximum growth rate and final density (p < 0.05) compared to Lm serotype 1/2a strains. Regarding the virulence potential, there were no statistical differences among serotypes with respect to its hemolytic activity, however, the invasiveness of serotype 4b strains in Caco-2 cells was higher (p <0.05) than serotype 1/2a. Furthermore, comparative analyzes before and after osmotic stress confirmed the increased potential for invasion (p < 0.05) in both serotypes (1/2a and 4b) after being submitted to high salt concentrations. The role of transcription regulators sigma B and PrfA in L. monocytogenes survival under osmotic stress condition was also evaluated. Microarray assay using lineage I and II strains showed increased transcription levels in 173 and 68 genes, respectively, when comparing the wild type strains to the mutant ΔsigB strain. This included genes related to virulence (internalina), survival under stress conditions and metabolic genes. The results confirm the ability of Lm strains in remain viable or even grow at low temperatures and in high osmotic pressure environments, regardless of serotype or origin. They also emphasize the need for effective measures to control this pathogen by food industry since it is possible that Lm strains survive under adverse conditions and also increase its virulence potential. The data also indicate the need for additional studies regarding the behavior of Lm in environments with modified sodium chloride concentration since the discussion about salt levels in foods is increasing worldwide.
 
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Data de Publicação
2013-06-14
 
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