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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.9.2019.tde-09122019-190659
Document
Author
Full name
Camila Hiromi Chiba
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2019
Supervisor
Committee
Stephano, Marco Antonio (President)
Camargo, Lívia Seno Ferreira
Novo, Juliana Branco
Oliveira, Ricardo Pinheiro de Souza
Title in Portuguese
Produção da proteína recombinante Interferon-β1b na plataforma se síntese proteica livre de célula
Keywords in Portuguese
Cell-free
DNA linear
Escherichia coli
Interferon
Proteínas recombinantes
Abstract in Portuguese
Biofármacos e produtos imunobiológicos representam uma parcela significativa no mercado farmacêutico global. Cerca de 400 milhões de pessoas em todo o mundo dependem desses produtos e, muitas vezes, necessitarão delas para o resto de suas vidas. Até o momento, a tecnologia convencional para síntese dessas proteínas recombinantes é a expressão baseada em células. Porém, este sistema está frequentemente associado a problemas como a degradação da proteína-alvo devido à presença de nucleases e proteases, agregação com formação de corpos de inclusão e perda de molde de DNA. A plataforma de síntese proteica livre de células (do inglês Cell-Free Protein Synthesis ou CFPS) tem surgido como uma alternativa à expressão baseada em célula, permitindo a síntese de diversas proteínas, inclusive as de difícil expressão, na forma solúvel, em elevado rendimento e com capacidade de escalonamento. Este estudo buscou sintetizar a proteína interferon-β1b humano recombinante (rhINF-β1b) no sistema CFPS. Através de um trabalho de bioinformática, otimizou-se a sequência nucleotídica da proteína para expressão em lisado de E. coli e construiu-se um vetor de expressão linear, contendo promotor T7, RBS, região codificadora e um terminador T7. O sistema CFPS aceita molde de DNA no formato linear, que possui a vantagem de agilidade na preparação, sem a necessidade das etapas de clonagem, transformação, cultivo, extração e purificação do DNA. Também foi testado a expressão em DNA plasmidial, em que o gene do IFN foi clonado em vetor TOPO-TA Cloning. Para comparar os níveis de expressão foi utilizado esses mesmos vetores no sistema baseado em célula, com cepas de BL21(DE3) e Rosetta(DE3). Apesar da proteína de interesse não ter sido sintetizada com sucesso no sistema CFPS, foram dados alguns passos importantes para atingir este objetivo. No futuro, uma das prioridades é padronizar um sistema livre de células do laboratório capaz de fornecer um elevado rendimento para síntese de proteínas.
Title in English
Cell-free protein synthesis of recombinant Interferon-β1b
Keywords in English
Cell-free
Escherichia coli
Interferon
Linear DNA template
Recombinant proteins
Abstract in English
Biopharmaceutical and immunobiological products represent a growing share of the global pharmaceutical market. Around 400 million people worldwide are dependent of such proteins and, often, they are going to need for the rest of their lives. So far, the most employed biopharmaceutical production technology is cell-based expression. However, this system is usually associated with problems such as degradation of proteins due to the presence of endogenous nucleases or proteases, aggregation with inclusion bodies formation and loss of DNA template. Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) platform has emerged as an alternative to cell-based expression, allowing synthesis of many types of proteins, including difficult-to-express proteins, proteins in soluble form, in high yield and possibility to scale up or down the process. This work sought to synthesize recombinant human interferon-β1b (rhINF-β1b) in CFPS system. Through a bioinformatics study, a nucleotide sequence of the target protein was optimized for expression in E. coli lysate and a linear DNA template was designed, containing a T7 promoter, a RBS, a coding sequence and a T7 terminator. The CFPS system accepts linear template DNA, which has the advantage of agility in the preparation, without the need for the steps of cloning, transformation, cultivation, extraction and purification of DNA template. Expression in plasmid DNA was also tested, wherein the IFN gene was cloned into TOPO-TA Cloning vector. To compare expression levels, the same vectors were used in the cell-based system with BL21 (DE3) and Rosetta (DE3) strains. Although the protein of interest was not successfully synthesized in the CFPS system, some important steps were taken to achieve this goal. In the future, one of the priorities is to standardize the lysate preparation for a high throughput protein production.
 
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Publishing Date
2019-12-13
 
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