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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.9.2003.tde-25062012-114829
Documento
Autor
Nome completo
Marina Ishii
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2003
Orientador
Banca examinadora
Penna, Thereza Christina Vessoni (Presidente)
Ohara, Mitsuko Taba
Pessoa Junior, Adalberto
Título em português
Determinação dos parâmetros cinéticos de resistência térmica da Proteína Verde Fluorescente recombinante (GFPuv)
Palavras-chave em português
Biotecnologia
Esterilização de alimentos
Indicador biológico
Microbiologia aplicada
Processos térmicos
Proteína Verde Fluorescente
Resistência térmica
Valor D
Valor z
Resumo em português
Células transformadas de E.coli DH5-α expressando a proteína verde fluorescente (GFPuv, pico de excitação e emissão de 394nm e 509nm) foram submetidas a extração pelo método de partição de três fases (TPP) e o extrato obtido purificado por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). O objetivo principal deste trabalho foi estudar a termoestabilidade da GFPuv extraída, para avaliar a sua possível utilização como indicador biológico econômico, de resposta rápida e precisa para processos térmicos de esterilização utilizando o calor úmido. A estabilidade térmica da proteína foi estudada em diferentes soluções-tampão (acetato, fosfato e tris-HCI 10mM) no intervalo de valor de pH de 5,O a 9,0 e, em temperaturas entre 75° e 95°C. Os parâmetros de resistência térmica determinados foram: o tempo de redução decimal (Valor D - min), valor z (°C), coeficiente Q10 e valor de energia de ativação (kcal/mol). A termoestabilidade da GFPuv, expressa em valor D, mostrou correlação linear para valores de pH ≥ 5,50, em tampão acetato. Em tampão fosfato, para valores de pH ≥ 7,50 a estabilidade térmica da proteína foi independente do valor de pH da solução. Em tampão tris-HCI, o valor D mostrou-se inconstante ao aumento do valor de pH da solução. No intervalo de temperatura estudada, em tampão acetato a GFPuv apresentou melhor termoestabilidade (Ea de 19,27 kcal/mol) do que em tampão fosfato (Ea de 26,18 kcal/mol ao valor de pH 6,S) e em tampão tris-HCI (Ea 28,19 kcallmol ao valor de pH 7,0). Em tampão acetato e tris-HCI ao valor de pH 7,0, a termoestabilidade da proteína mostrou-se equivalente. Entretanto, em tampão fosfato aos valores de pH 7,5 e 8,0 e em tampão tris-HCI aos valores de pH 8,0 e 8,5 a GFPuv apresentou menor estabilidade térmica A GFPuv apresenta potencialidade para ser utilizada como indicador biológico em processos térmicos que utilizam calor úmido às temperaturas inferiores a 100°C.
Título em inglês
Determination of kinetic parameters of thermal resistance of the Green Fluorescent Protein (GFPuv)
Palavras-chave em inglês
Applied microbiology
Biological indicator
Biotechnology
D-value
Food sterilization
Green Fluorescent Protein
Thermal processes
Thermal resistance
z-value
Resumo em inglês
Transformed cells of Escheríchía coli DH5-α expressing recombinant green fluorescent protein (GFPuv, excitation and emission peaks at 394nm and 509nm), were subjected to the three-phase partitioning (TPP) method and the release extracts were eluted through methyl HIC column with a buffer solution (10 mM Tris-HCI, 10mM EDTA, pH=8.0). The purpose of this work was to study the thermal stability of the TPP-extracted recombinant protein, GFPuv, to determine its utility as a quick, accurate and economical biological indicator for moist heat-treatments. The thermal stability of the extracted GFPuv was studied in different buffer solutions (acetate, phosphate and tris-HCI 10mM) in the range of pH between 5.0 and 9.0 and at temperature between 75-95°C. The thermal resistance parameters determinated were: decimal reduction times (D-values, min), z-value (۰C), Q coefficient and Activation Energy (Ea, Kcal/mol). The thermal stability of GFPuv, expressed in D-values, showed linear correlation for pH ≥ 5.50 in acetate buffer. In phosphate buffer, for pH ≥ 7.50 the thermal stability was independent of pH value. In tris-HCI buffer the D-value was shown variable with the increase of pH value. In the studied temperature range, the acetate buffer at pH 6.0 presented better thermal stability for GFPuv (Ea 19.27kcal/mol) than phosphate (Ea 26.18 kcal/mol at pH 6.5) and tris-HCI buffer (Ea 28.19 kcal/mol at pH 7.0). In acetate and tris-HCI buffers at pH 7.0, GFPuv showed equivalent thermal stability. However, GFPuv showed lower thermal stability in phosphate buffer at pH 7.5 and 8.0 and in tris-HCI buffer at pH 8.0 and 8.5. The TPP-extracted GFPuv has great potential to be applied as a biological indicator in moist heat processes at temperatures below 100°C.
 
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Data de Publicação
2012-06-25
 
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