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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.9.2017.tde-21072017-160650
Document
Author
Full name
Paulo Henrique Lage Carbone
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2007
Supervisor
Committee
Hirata, Mario Hiroyuki (President)
Cardoso, Rosilene Fressatti
Leite, Clarice Queico Fujimura
Melo, Fernando Augusto Fiuza de
Sato, Daisy Nakamura
Title in Portuguese
Contrução do fago recombinante D29::gfp com potencial de aplicação nos testes de sensibilidade pela concentração inibitória mínima para o Mycobacterium spp.
Keywords in Portuguese
Bacteriófago recombinante
Concentração inibitória mínima
Mycobacterium tuberculosis (Identificação)
Proteína verde fluorescente
Testes de química clínica (Desenvolvimento)
Tuberculose (Quimioterapia)
Abstract in Portuguese
O objetivo desse trabalho foi construir o fago recombinante D29::gfp e testar a sua utilização como um agente revelador da viabilidade bacilar na determinação da concentração inibitória mínima (GIM) aos principais fármacos administrados no tratamento da tuberculose. O fago recombinante contém o promotor hsp70 e o gene da proteína verde fluorescente (gfp) e foi construído através da restrição pela Spe I em uma região intergênica próxima a extremidade coesiva direita no genoma do fago D29. O promotor hsp70 e gfp clonados no pYL GFP foram amplificados pela PCR utilizando iniciadores com sítios para Spe I. O DNA do fago D29 digerido pela Spe I foi ligado com o fragmento hsp 70- gfp empregando a T 4 DNA ligase e os produtos da reação de ligação foram transformados de acordo com o protocolo de encapsulamento. A infecção do M.smegmatis com esse fago recombinante induziu a expressão da proteína verde fluorescente (GFP). Para avaliar o uso do fago recombinante em teste de sensibilidade aos fármacos anti-tuberculose, 100 isolados clínicos foram testados quanto ao perfil de sensibilidade a isoniazida (H), rifampicina (R), estreptomicina (S) e etambutol (E), utilizando o método das proporções em Lowenstein-Jensen (L-J), técnica em microplaca com a resazurina (REMA) e técnica em microplaca com D29::gfp. Os resultados do REMA demonstraram que 30 isolados clínicos foram sensíveis à H e 58 (66 %) isolados clínicos foram resistentes, dentre os quais a CIM foi 1 µg/mL ou maior para 41 (71 %). A CIM da R para 49 (56%) dos isolados clínicos resistentes foi de 0,5 µg/mL para 17 (35%). A CIM da S para 33 (37%) dos isolados clínicos resistentes foi de 2 µg/mL para 13 (40%) e CIM do E para 34 (39%) dos isolados clínicos resistentes foi de 16 µg/mL ou maior para 19 (56%). A caracterização molecular pela PCR IS6110 identificou 88 isolados clínicos como M.tuberculosis e pelo PRA hsp65, sete isolados clínicos foram M.kansasii, quatro foram M.abscessus e um M.szulgai. Após empregar o fago recombinante como um agente indicador da viabilidade bacilar para testar a atividade dos fármacos anti-tuberculose conclui-se que a expressão da proteína verde fluorescente foi inespecífica e não reprodutiva, não justificando o seu uso para determinar a CIM para os principais fármacos administrados no tratamento da tuberculose.
Title in English
Construction of the recombinant phage D29::gfp with application potential in sensitivity tests by the minimum inhibitory concentration for Mycobacterium spp.
Keywords in English
Clinical Chemistry (Developmental)
Green fluorescent protein
Minimal inhibitory concentration
Mycobacterium tuberculosis (Identification)
Recombinant phage
Tuberculosis (Chemotherapy)
Abstract in English
The objective of this work was to construct the recombinant phage D29::gfp and to use this phage as an indicator agent of cell viability in a minimal inhibitory concentration (MIC) assay for the mains drugs used for tuberculosis treatment. The recombinant phage contains the mycobacteria-specific hsp70 promoter controlling the green fluorescent protein gene (gfp) and was constructed by Spe I restriction in the intergenic region next to the right cohesive termini of the D29 phage genome. An hsp 70 promoter and gfp previously cloned in p YL GFP was amplified by PCR using primers with Spe I sites. The Spe I-restricted D29 phage DNA was ligated with the hsp 70-gfp fragment using T4 DNA ligase and ligated product was transformed using the packing protocol. Infection of M.smegmatis with this recombinant phage indicated the expression of green f1uorescent protein (GFP). To use the recombinant phage for assaying the activity of anti-TB drugs, 100 clinical isolates was tested for susceptibility to isoniazid (H), rifampicin (R), streptomycin (S), and ethambutol (E) using both the proportion method on Lowenstein-Jensen (L-J) medium, resazurin microtiter assay plate (REMA), as well as a microplate assay using D29::gfp. The REMA plate method showed that 30 clinical isolates were susceptible to H and 58 (66%) clinical isolates were resistant, where the MICs were 1 µg/mL or higher for 41 (71%). The R MICs for 49 (56%) resistant clinical isolates were 0,5 µg/mL for 17 (35%). The S MICs for 33 (37%) resistant clinical isolates were 2 µg/mL for 13 (40%) and E MICs for 34 (39%) resistant clinical isolates were 16 µg/mL or higher for 19 (56%). Molecular characterization by PCR IS6110 showed that 88 clinical isolates were M.tuberculosis and by PRA hsp65 were seven clinical isolates were M.kansasii and four was M.abscessus, and one M.zulgai. After using the recombinant phage as an indicator agent of cell viability for assaying the activitity of anti-TB drugs we can conclude that the expression of green fluorescent protein was non-specific and not reproducible, rendering it not useful for the determination of the MIC of the principal drugs used for the treatment of tb.
 
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Publishing Date
2017-07-21
 
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