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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.9.2010.tde-24052010-162400
Document
Author
Full name
Adriana Bulgarelli
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2010
Supervisor
Committee
Maranhão, Raul Cavalcante (President)
Farsky, Pedro Silvio
Gomes, Ligia Ferreira
Maria-Engler, Silvya Stuchi
Nicolau, José Carlos
Title in Portuguese
Uso de metotrexato associado à nanopartícula rica em colesterol (LDE) para tratamento da aterosclerose
Keywords in Portuguese
Aterosclerose
Metotrexato
Nanopartícula
Abstract in Portuguese
O Metotrexato (MTX) é um fármaco utilizado como anti-inflamatório no tratamento da artrite reumatóide (AR). O risco de doença cardiovascular em pacientes com AR é menor quando tratados com MTX. Apesar dessa evidência, há poucos relatos da utilização de MTX para o tratamento da aterosclerose. Foi desenvolvida em nosso laboratório uma nanopartícula rica em colesterol (LDE), a qual é reconhecida pelos receptores da lipoproteína de baixa densidade (LDLr) após injeção na corrente sangüínea. A LDE concentra-se em células com hiperexpressão de LDLr, em processos proliferativos como a aterosclerose. Dessa maneira, a LDE pode ser utilizada como veículo para o direcionamento de fármacos contra essas células. A molécula de MTX foi latenciada e a modificação do fármaco aumentou a sua incorporação à LDE. A proposta desse estudo foi avaliar a eficácia de MTX associado à LDE (LDE-MTX) no tratamento da aterosclerose em coelhos além de investigar o efeito desse complexo na expressão de genes inflamatórios que participam do processo aterogênico. Para realização do estudo foram utilizados quatro grupos de 10 coelhos (raça New Zealand) cada, sendo que todos foram submetidos a uma dieta rica em colesterol por 8 semanas. Após as primeiras 4 semanas de dieta, os grupos foram tratados com LDE-MTX (grupo LDE-MTX), MTX comercial (grupo MTX comercial), LDE (grupo controle LDE) ou solução salina (grupo controle Salina), via endovenosa por 4 semanas. O grupo LDE-MTX não apresentou toxicidade ao longo do tratamento de acordo com os parâmetros utilizados, enquanto que o grupo MTX comercial apresentou uma queda acentuada de eritrócitos ao final do tratamento (p<0,001). A análise morfométrica macroscópica mostrou que os grupos LDE-MTX e MTX comercial reduziram as lesões ateroscleróticas quando comparados ao grupo controle Salina (66 e 76%, respectivamente) (p<0,001). Por microscopia, a camada íntima do arco aórtico e torácico foi reduzida nos grupos LDE-MTX (67% e 75%) e MTX comercial (81% e 92%, respectivamente) quando comparados com os mesmos fragmentos do grupo controle Salina (p<0,05). A presença de macrófagos na camada íntima dos grupos LDE-MTX e MTX comercial foi reduzida em 59% e 57% (p<0,001) no arco aórtico e 37% e 38% na região da aorta torácica (p=0,016) em relação ao grupo controle Salina, respectivamente. A porcentagem de MMP-9 no arco aórtico foi reduzida em 48% em ambos os grupos tratados (p=0,0003), enquanto que na aorta torácica LDE-MTX e MTX comercial diminuíram 54% e 66% (p<0,0001) respectivamente, em relação ao grupo controle Salina. Na região da aorta abdominal, a redução de MMP-9 também foi observada nos grupos LDE-MTX (68%) e MTX comercial (70%) (p=0,016). Quando se comparou ao grupo controle LDE, os dois grupos tratados tiveram porcentagens semelhantes de redução em todas as análises morfométricas. Nos estudos de expressão gênica in vivo, 5 genes inflamatórios se mostraram hipoexpressos (TNF-α, MCP-1, IL-1β, IL-18 e MMP-12) e um gene (IL-10) apresentou aumento de expressão no arco aórtico de coelhos tratados com LDE-MTX em relação ao grupo controle. No experimento in vitro, 5 dos 10 genes (TNF-α, VAP-1, IL-1β, CXCL2 e TLR2) avaliados tiveram redução da expressão e 1 (TGF-β1) se mostrou hiperexpresso na linhagem de endotélio humana (HUVEC) tratada com as duas formulações de MTX. Os resultados indicam que tanto a LDE-MTX quanto MTX comercial reduzem acentuadamente as lesões ateroscleróticas em coelhos e parecem minimizar a resposta inflamatória na doença aterosclerótica. Contudo, LDE-MTX apresentou uma tolerabilidade maior ao tratamento, pois não apresentou toxicidade hematológica em comparação com MTX comercial.
Title in English
Use of methotrexate associated to a cholesterol-rich nanoparticle (LDE) for atherosclerosis treatment
Keywords in English
Atherosclerosis
LDE
Methotrexate
Abstract in English
Methotrexate (MTX) is the most frequently used drug for rheumatoid arthritis treatment. The incidence of vascular disease in these patients is lower when treated with MTX. However, few studies have been done using MTX for atherosclerosis treatment. In previous studies, we showed that, after injection into blood stream, a cholesterol-rich nanoparticle (LDE) binds to low density lipoprotein receptors (LDLr) and concentrates in tissues with intense cell proliferation such as atherosclerosis. LDE may thus carry drugs directed against those tissues reducing the toxicity of chemotherapeutic agents. For stable association with LDE, a lipophylic methotrexate derivative was used. The purpose of this study was to test MTX associated to LDE (LDE-MTX) in rabbits with atherosclerosis and investigate their anti-inflammatory effects on inflammatory mediators. Atherosclerosis was induced in rabbits by cholesterol rich diet during eight weeks. After 4 weeks from the introduction of the atherogenic diet, 4 groups of 10 animals were treated with LDE-MTX (LDE-MTX group), commercial MTX (commercial MTX Group), LDE (LDE control group) and saline solulion (Saline control group). MTX dose in both preparations was 4mg/kg/week during 4 additional weeks. LDE-MTX group showed superior tolerability with pronouncedly lesser hematologic toxicity in comparison to commercial MTX (p< 0.001). By morphometric analysis, both LDE-MTX and commercial MTX treatment groups showed a pronounced reduction of lesion area compared with Saline control group (66-76% respectively) (p<0001). By microscopy, intimal width at aortic arch and thoracic segments was reduced by 67% and 75% in LDE-MTX group compared to Saline control group, respectively (p<0.05). Commercial MTX group showed a reduction of 81% and 92% at aortic arch and thoracic segments compared to Saline control group, respectively (p<0.05). Presence of macrophages in intima layer at aortic arch was reduced by 59% and 57% (p<0.001) in LDE-MTX and commercial MTX groups while at thoracic segments was diminished by 37% and 38% (p=0.016) compared to Saline control group, respectively. MMP-9 percentage was diminished by 48% in both treated groups at aortic arch (p=0.0003) while at thoracic segment, LDE-MTX and commercial MTX reduced by 54% and 66% (p<0.0001) compared to Saline control group, respectively. Furthermore, MMP-9 percentage also diminished at abdominal segment in LDE-MTX group (68%) and commercial MTX (70%) when compared to Saline control group (p=0,016). When compared to LDE control group, both treated groups had similar percentage reduction in all morphometric analysis. In vivo studies, the expression of 5 inflammatory genes was downregulated (TNF-α, MCP-1, IL-1β, IL-18 and MMP-12) and 1 was upregulated (IL-10) when rabbits with induced atherosclerosis were treated with LDE-MTX. Besides, 5 inflammatory genes were downregulated (TNF-α, VAP-1, IL-1β, CXCL2 e TLR2) and 1 was upregulated (TGF-β1) when human endothelial cell line (HUVEC) was treated with both MTX preparations. Therefore, MTX can be an effective drug for atherosclerosis treatment and associated to LDE, side effects of this chemotherapeutic agent can be minimized.
 
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Publishing Date
2010-07-05
 
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