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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.9.2016.tde-29042016-125624
Document
Auteur
Nom complet
Maristela Tsujita
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2004
Directeur
Jury
Monteiro, Hugo Pequeno (Président)
Abdalla, Dulcineia Saes Parra
Laurindo, Francisco Rafael Martins
Titre en portugais
Estudo da S-nitrosação de Ras e participação das MAP quinases (ERK, JNK e p38) na apoptose de células THP-1 induzida por óxido nítrico
Mots-clés en portugais
Apoptose (Estudo clínico)
Biologia celular
Bioquímica clínica
Resumé en portugais
Ras é uma proteína G monomérica que converte estímulos extracelulares em sinais bioquímicos intracelulares e controla uma variedade de processos biológicos, tais como, proliferação, diferenciação, adesão e morte celular por apoptose. Além da ativação mediada por fatores de crescimento e hormônios, Ras pode ser ativado pela interação com o óxido nítrico (NO·), um radical capaz de mediar processos de sinalização. Essa interação resulta na S-nitrosação do resíduo de cisteína 118 de Ras. Assim, propusemo-nos avaliar a participação da proteína Ras e das MAP quinases: ERK1/2, JNK e p38 no processo de apoptose de células THP-1 induzida pelo doador de NO·, S-nitrosoglutationa (SNOG). Para tanto, transfectamos células THP-1 com o plasmídeo que carrega o gene que codifica para a proteína Ras mutada, na qual o resíduo de cisteína 118 foi trocado por um resíduo de serina, o que tornou Ras não responsiva ao NO·. A apoptose foi evidenciada através da formação de corpos apoptóticos, exposição de fosfatidilserina e ativação de caspase-3. A modulação da apoptose via reação de S-nitrosação foi demonstrada através da diminuição estatisticamente significativa da exposição de fosfatidilserina nas células transfectadas com o plasmídeo p21 RasC118S quando comparadas com as células selvagens e parentais. A ativação da proteína Ras ocorreu após 5, 15 e 30 minutos da adição de SNOG nas células parentais; entretanto, nas células transfectadas com o plasmídeo p21 RasC118S não observamos resposta de ativação de Ras. A avaliação das MAP quinases revelou ativação de máxima de ERK após 4 horas e ativação máxima de JNK e p38 após 2 horas de incubação com SNOG. Em relação as MAP quinases nas células transfectadas, as células p21 RasC118S apresentaram diminuição apenas da ativação ERK, quando comparadas com as células p21RasWt. A utilização dos inibidores específicos de MEK, JNK e p38; PD09895, CEP11004 e SB22004, respectivamente demonstrou que apenas a inibição de ERK diminuiu significativamente a apoptose nas células THP-1. Concluímos que na apoptose de células THP-1 estimulada por NO·, o radical livre ativa Ras via S-nitrosação, que por sua vez, recruta ERK, MAP quinase participante desta cascata de sinalização. Finalmente, demonstramos que ERK exerce papel fundamental na condução do sinal de apoptose no modelo que estudamos.
Titre en anglais
Study s-nitrosation of Ras and participation of MAP kinases (ERK, JNK and p38) in THP-1 cell apoptosis induced by nitric oxide
Mots-clés en anglais
Apoptosis (Clinical study)
Cell biology
Clinical biochemistry
Resumé en anglais
Ras is a monomeric small G protein that converts intracellular stimulus into intracellular biochemical signals. Ras controls a myriad of biological processes such as, proliferation, differentiation, adhesion and cell death by apoptosis. In addition to growth factor-mediated activation of Ras, nitric oxide (NO·) directly interacts with and activates Ras via S-nitrosation on a single cysteine residue (Cys118). Therefore, we investigated the participation of Ras and of the MAP kinases (ERK, JNK and p38) in the apoptosis of THP-1 cells induced by the NO· donor S-nitrosoglutathione (SNOG). For that, we transfected THP-1 cells with a plasmid that contains the gene that codifies for the mutated Ras protein, in which the cysteine residue 118 was replaced by a serine. Apoptosis was evidenced by apoptotic bodies formation, phosphatidylserine exposition and caspase-3 activation. Parental and wild type Ras transfected-THP-1 cells (Wt) exposed phosphatidylserine upon treatment with 1.0 mM SNOG. The importance of the S-nitrosation reaction in the process was evidenced by a decrease on phosphatidylserine exposition in the cells transfected with the plasmid p21RasC118S, as compared to parental and wild type cells. Ras activation occurred within the first 30 minutes after SNOG addition to parental cells. However in p21RasC118S transfected cells, we were unable to detect activation of Ras. Regarding the MAP kinases located downstream on the Ras-mediated signaling cascade, ERK activity was maximum after 4 hours incubation with the NO· donor. JNK and p38 MAP kinase followed different kinetics, displaying maximum activity after 2 hours incubation with SNOG. The use of specific inhibitors to MEK, JNK and p38; PD09895, CEP11004 and S822004 respectively has shown that only ERK inhibition has significantly decreased THP-1 cells apoptosis. We concluded that NO· induced apoptosis in THP-1 cells activating Ras by S-nitrosation and recruiting the MAP kinase ERK, a downstream element of this signaling cascade. Furthermore, our findings support a major role for ERK in the NO· mediated apoptosis of THP-1 cells.
 
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Date de Publication
2016-04-29
 
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