• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.9.2011.tde-12072013-143454
Document
Author
Full name
Felipe Augusto Dörr
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2011
Supervisor
Committee
Pinto Junior, Ernani (President)
Carvalho, Valdemir Melechco
Katzin, Alejandro Miguel
Lopes, Norberto Peporine
Yonamine, Maurício
Title in Portuguese
Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas: aplicações para o estudo de toxinas produzidas por cianobactérias
Keywords in Portuguese
Cianobactéria
Cianotoxinas
Cromatografia líquida
Electrospray
Espectrometria de massas
Abstract in Portuguese
A crescente demanda por água doce de boa qualidade, associada ao aumento na frequência de florações tóxicas de cianobactérias em reservatórios utilizados para consumo humano, levou à publicação da Portaria nº. 518/04 pelo Ministério da Saúde. Entre outros parâmetros de potabilidade, as empresas fornecedoras de água tratada devem realizar o monitoramento de cianotoxinas. Para tanto, métodos analíticos rápidos e precisos para a determinação destes compostos são imprescindíveis. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo empregar a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas para o estudo das principais cianotoxinas em território nacional: microcistinas, anatoxina-a(s), cilindrospermopsina e saxitoxinas. Os resultados obtidos estão distribuídos em capítulos específicos dedicados a cada grupo de toxinas. Dessa forma, o primeiro capítulo apresenta um estudo de fragmentação na fase gasosa de ânions de microcistinas em um equipamento do tipo orbitrap. É demonstrado que o modo negativo de ionização por electrospray fornece informações estruturais importantes e complementares ao modo positivo de ionização. Uma abertura seletiva do peptídeo cíclico é proposta e mecanismos discutidos, o que facilita a interpretação de resultados durante a caracterização de variantes desconhecidas. O modelo de fragmentação desenvolvido foi utilizado para identificar a variante [Leu1]MC-LR em um extrato de Microcystis spp. O segundo capítulo descreve metodologias qualitativas de LC/MS para o monitoramento e identificação do organofosforado natural anatoxina-a(s), cuja análise é prejudicada pela ausência de padrões comerciais. A cromatografia de interação hidrofílica foi empregada e mecanismos de fragmentação na fase gasosa propostos, discutindo-se os íons característicos desta estrutura química. Tal modelo permitiu a identificação desta toxina nas cepas de Anabaena oumiana ITEP-25 e ITEP-26 pela primeira vez. O terceiro capítulo disserta sobre os mecanismos de fragmentação na fase gasosa da toxina cilindrospermopsina quando ionizada por electrospray na forma de aduto com metais alcalinos. Diferenças nas vias de fragmentação são demonstradas de acordo com o raio atômico do metal formador do aduto, com implicações práticas na sua determinação cromatográfica. Já o quarto capítulo discute os mecanismos de fragmentação de variantes sulfatadas de saxitoxinas (GTX1e4, GTX2e3, dcGTX2e3, GTX5) após ionização por electrospray no modo positivo e negativo. É demonstrado pela primeira vez que uma conformação estrutural específica do grupamento sulfato explica a intensa eliminação de SO3 observada para as variantes GTX1, GTX2 e dcGTX2 no modo positivo de ionização. Por outro lado, o modo negativo de ionização apresenta vantagens uma vez que a dissociação na fonte é insignificante se comparada à dissociação observada no modo positivo. Como resultado, métodos quantitativos no modo negativo podem apresentar maior sensibilidade, permitindo a detecção destas toxinas em amostras ambientais em quantidades mais baixas. De maneira geral, conclui-se que a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas é ferramenta poderosa para a análise quali e quantitativa das principais cianotoxinas, podendo ser amplamente empregada para o monitoramento de água para consumo humano.
Title in English
Liquid-chromatography coupled to mass spectrometry: applications for the study of toxins produced by cyanobacteria
Keywords in English
Cyanobacteria
Cyanotoxins
Electrospray ionization
Liquid chromatography
Mass spectrometry
Abstract in English
The increasing occurrence of toxic cyanobacterial blooms in reservoirs used to supply drinking water for human consumption has prompted the publication of resolution 518/04 by the Brazilian Ministry of Health. Among other quality requirements, the monitoring of cyanotoxins in treated water is mandatory for companies responsible for potable water distribution. Therefore, precise and rapid analytical methods are essential. In this context, the aim of this work is to employ liquid chromatography coupled to mass spectrometry to study the most important cyanotoxins in our country: microcystins, anatoxin-a(s), cylindrospermopsis and saxitoxins. The obtained results are distributed in four chapters, each one dedicated to a single group of toxins. In this way, chapter one presents the gas-phase fragmentation behavior of deprotonated microcystins in an Orbitrap instrument. It is demonstrated that electrospray negative ionization can provide significant structural information about microcystins. These results are complementary to the positive ionization mode. A selective ring opening process is proposed and possible mechanisms are discussed, which may facilitate data interpretation when unknown variants are considered. The general fragmentation model was further applied to the characterization of [Leu1]MC-LR in a Microcystis spp. cell extract. The second chapter describes qualitative analytical methods for the identification of anatoxin-a(s), a natural organophosphate whose determination is hampered by the lack of commercial standards. Hydrophilic interaction liquid chromatography was employed and fragmentation mechanisms proposed, identifying the characteristic product ions of this toxin. The developed methods were further used to identify anatoxin-a(s) for the first time in Anabaena oumiana strains ITEP-25 and ITEP-26. The third chapter presents data related to the gas-phase fragmentation behavior of cylindrospermospin when this toxin is ionized as metal adducts. Different fragmentation pathways are accessed depending on the atomic radius of the metal cation involved. Practical implications for the chromatographic analysis of this toxin are presented. The last chapter describes the fragmentation behavior of sulphate-containing saxitoxin variants (GTX1&4, GTX2&3, dcGTX2&3, GTX5) after electrospray ionization in both the positive and negative modes. A mechanism for the intense SO3 elimination from [M+H]+ ions from GTX1, GTX2 and dcGTX2 is proposed for the first time and relies on a specific structure conformation. On the other hand, the negative ionization mode shows much less in-source dissociation when compared to the positive mode. As a consequence, methods based on negative ionization might be more sensitive for sulfate-containing variants, allowing the detection of lower amounts of these toxins in environmental samples. At the end, it can be concluded that liquid chromatography is a well-suited and powerful technique for the qualitative and quantitative analysis of cyanotoxins, being an invaluable contribution to water safety evaluation.
 
WARNING - Viewing this document is conditioned on your acceptance of the following terms of use:
This document is only for private use for research and teaching activities. Reproduction for commercial use is forbidden. This rights cover the whole data about this document as well as its contents. Any uses or copies of this document in whole or in part must include the author's name.
Publishing Date
2013-07-25
 
WARNING: Learn what derived works are clicking here.
All rights of the thesis/dissertation are from the authors
Centro de Informática de São Carlos
Digital Library of Theses and Dissertations of USP. Copyright © 2001-2020. All rights reserved.