Tese de Doutorado

Cell signaling pathways are complex. Despite tools like KEGG, Reactome, and STRING aim for a reliable reconstruction, the static nature of their maps cannot fully comprise the complex networks. Differently, dynamic modeling allow reliable reconstructions, with the advantage of unveiling new knowledge by perturbing the system. However, this reliability comes into account of a high-cost of information that is often unavailable, making the modeling often challenging. Our research group has opted for using ordinary differential equations (ODE) modeling of to represent the KRas-GTP activation by SOS in Y1 mouse adrenocortical carcinoma cells. This cell line presents amplification of the KRas oncogene and has high-basal levels of KRAS-GTP, which its activation is mediated by the GEF SOS. The model revealed that SOS only is not sufficient to reach the high-basal levels of KRAS-GTP experimentally observed for this cell line. Interestingly, by adding another GEF in the model, the expected KRAS activation levels was reached, leading to the hypothesis that there was a missing element in this system. Further investigation has pointed RASGRP4 as a possible missing GEF. In this thesis, the hypothesis was confirmed by performing CRISPR in the Y1 cell against the GRP4 protein, followed by ELISA assays that showed differential KRAS-GTP basal levels of the Y1 and Y1 ΔGRP4. Sequently, tumor growth assays in Balb/c-NUDE mice, showed reduced tumor growth and frequency for the Y1 ΔGRP4 cells. This result gives us the glance that the role of GEFs is undermined and much more can be learned from complex networks if the dynamic models could be extensively expanded. Moved by that, a dataset aimed to be used for modeling purposes was created. Using high-resolution mass spectrometry, a proteome (DIA, Q-Exactive™) and phosphoproteome (TMT-labeled DDA, Orbitrap Fusion Lumos™) of the Y1 cell in a 0 to 30 minute timespan under FGF2, SOS inhibitor + FGF2, with or without FBS stimulation, in triplicates was generated. Lastly, an exploratory analysis was performed on the data to highlight the most important changes, including newly reported phosphorylation sites. This dataset will be used to compose future dynamic models, which can play a game-changing role in cancer and drug discovery research.

As vias de sinalização celular são complexas. Apesar de ferramentas como KEGG, Reactome e STRING visarem uma reconstrução confiável, a natureza estática de seus mapas não consegue abranger completamente as redes complexas. Diferentemente, a modelagem dinâmica permite reconstruções confiáveis, com a vantagem de revelar novos conhecimentos ao perturbar o sistema. No entanto, essa confiabilidade implica um alto custo de informação, que muitas vezes não está disponível, tornando a modelagem frequentemente desafiadora. Nosso grupo de pesquisa optou por usar a modelagem por equações diferenciais ordinárias (EDO) para representar a ativação de KRas-GTP por SOS em células de carcinoma adrenocortical de camundongo Y1. Essa linhagem celular apresenta amplificação do oncogene KRas e possui altos níveis basais de KRAS-GTP, cuja ativação é mediada pela GEF SOS. O modelo revelou que apenas a SOS não é suficiente para atingir os altos níveis basais de KRAS-GTP observados experimentalmente para essa linhagem celular. Curiosamente, ao adicionar outra GEF ao modelo, os níveis esperados de ativação de KRAS foram alcançados, levando à hipótese de que havia um elemento ausente nesse sistema. Investigações adicionais apontaram a RASGRP4 como uma possível GEF ausente. Nesta tese, a hipótese foi confirmada pela realização de CRISPR na célula Y1 contra a proteína GRP4, seguida por ensaios de ELISA que mostraram níveis basais diferenciais de KRAS-GTP entre as células Y1 e Y1 ΔGRP4. Subsequentemente, ensaios de crescimento tumoral em camundongos Balb/c-NUDE mostraram crescimento e frequência tumoral reduzidos para as células Y1 ΔGRP4. Esse resultado sugere que o papel das GEFs é subestimado e que muito mais pode ser aprendido sobre redes complexas se os modelos dinâmicos pudessem ser expandidos extensivamente. Motivados por isso, um conjunto de dados destinado a ser usado para fins de modelagem foi criado. Usando espectrometria de massa de alta resolução, um proteoma (DIA, Q-Exactive™) e um fosfoproteoma (DDA marcado com TMT, Orbitrap Fusion Lumos™) da célula Y1 em um período de 0 a 30 minutos sob estimulação com FGF2, inibidor de SOS + FGF2, com ou sem FBS, em triplicatas, foi gerado. Por fim, uma análise exploratória foi realizada nos dados para destacar as mudanças mais importantes, incluindo novos sítios de fosforilação relatados. Este conjunto de dados será utilizado para compor futuros modelos dinâmicos, que podem desempenhar um papel transformador na pesquisa sobre câncer e descoberta de medicamentos.