Tese de Doutorado

A placenta humana desempenha um papel relevante como barreira imune e mecânica. Apesar disso, patógenos virais ainda conseguem atravessar essa barreira, desregulando a homeostase fetal e a embriogênese. Ao avaliar pacientes com gestação gemelar infectadas com o vírus Zika, Amaral et al. (2020) (DOI:10.1371/journal.pntd.0008424) revelaram a expressão gênica diferencial de genes codificadores de proteína em trofoblastos (TFB) da placenta derivados de gêmeos dizigóticos discordantes para a Síndrome Congênita do Zika (SCZ). Entretanto, o papel dos RNAs longos não-codificadores (lncRNAs) no desenvolvimento de TFB não foi explorado. O objetivo deste estudo é identificar lncRNAs envolvidos na diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas induzidas (hiPSC) para TFB, bem como envolvidos na infecção pelo ZIKV e desenvolvimento de microcefalia. Dados de RNA-Seq de Amaral et al. foram re-mapeados no genoma de referência humano (GRCh38) utilizando um transcriptoma específico para hiPSC-TB, a ferramenta STAR, e um pipeline dedicado para identificar a expressão de lncRNAs. GffCompare foi usado para anotar novos transcritos, CPC2, CPAT e FEELnc, para predizer o potencial codificador de novos lncRNAs, e edgeR e limma, para análises de expressão diferencial. WGCNA foi usado para análises de redes de co-expressão, Metascape, para enriquecimento de termos de Ontologia Gênica (GO) e Cytoscape, para visualização das redes de módulos funcionais. O pipeline otimizado identificou 247 novos lncRNAs antissenso, 393 novos lncRNAs intrônicos e 102 novos lncRNAs intergênicos. Ao comparar hiPSC e TFB, foram encontrados 218 lncRNAs conhecidos e 26 novos com expressão diferencial em TFB (FDR < 0,001). A análise de redes de co-expressão revelou um módulo com correlação positiva significativa (0,99***) com a diferenciação de TFB, enriquecido com termos GO relacionados a “epithelial cell differentiation”, “tissue morphogenesis”, dentre outros; e um com correlação negativa significativa (-1,00***) relacionado a “brain development”, “circulatory system process”, dentre outros. Esses dois módulos concentraram 99,5% dos lncRNAs diferencialmente expressos (DE) em TFB. Ao comparar TFB dos gêmeos, antes e após a infecção pelo ZIKV, foram encontrados 96 lncRNAs conhecidos e seis novos com expressão diferencial em TFB infectados (FDR < 0,05). A análise de redes de co-expressão revelou dois módulos com correlação positiva significativa (0,99*** e 0,93**) com a infecção in vitro de TFB por ZIKV, concentrando 10,8% dos lncRNAs DE, alguns classificados como hub-genes. Esses módulos apresentaram enriquecimento de termos GO relacionados à “regulation of defense response to virus”, “response to interferon”, dentre outros. Notavelmente, nos TFBs infectados de gêmeos afetados pela microcefalia, foram detectados oito “imprinted genes” como DEGs, incluindo lncRNAs como H19 e MEG3. Esses achados demonstram uma reprogramação transcriptômica global na diferenciação de TFB e sugerem que a infecção dessas células por ZIKV desregula imprinted genes em gêmeos afetados pela microcefalia, indicando uma capacidade reduzida de resposta celular e um mecanismo de suscetibilidade ao desfecho neurológico grave. Os dados aqui registrados poderão subsidiar investigações adicionais visando a identificação de redes gênicas da placenta para melhor compreensão das bases moleculares do desenvolvimento e diferenciação de TFB e a identificação de modelos que descrevam os perfis de expressão de diferentes populações de células desse tecido.

The human placental plays a critical role as an immune and mechanical barrier. Notwithstanding, pathogens can still cross this barrier, disrupting fetal homeostasis and embryogenesis. When evaluating patients with twin pregnancies infected with the Zika virus (ZIKV), Amaral et al. (2020) (DOI:10.1371/journal.pntd.0008424) revealed a differential gene expression of protein-coding genes in placental trophoblasts (TB) derived from dizygotic twins discordant for Congenital Zika Syndrome (CZS). However, the role of long non-coding RNAs (lncRNAs) in TB development remained unexplored. The aim of the present study is to identify lncRNAs involved in the differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSC) into TB, as well as those associated with ZIKV infection and the development of microcephaly. RNA-Seq data from Amaral et al. were re-mapped to the human reference genome (GRCh38) using a hiPSC-TB specific transcriptome, the STAR alignment tool, and a dedicated pipeline to identify lncRNA expression. GffCompare was used to annotate novel transcripts, CPC2, CPAT, and FEELnc to predict the coding potential of novel lncRNAs. The edgeR and limma R packages were used for differential expression analysis; WGCNA was used for weighted gene co-expression network analysis, Metascape, for Gene Ontology (GO) enrichment analyses and Cytoscape, to visualize functional module networks. The optimized pipeline identified 247 novel antisense lncRNAs, 393 novel intronic lncRNAs, and 102 novel intergenic lncRNAs. When comparing hiPSC and TB, 218 known and 26 novel lncRNAs were found to be differentially expressed (DE) in TB (FDR < 0.001). Co-expression network analysis revealed one module with a significant positive correlation (0.99***) with TB differentiation enriched with GO terms related to “epithelial cell differentiation”, “tissue morphogenesis”, amongst others; and one with a significant negative correlation (-1.00***) enriched with GO terms related to “brain development”, “circulatory system process”, amongst others. These modules collectively comprised 99.5% of the DE lncRNAs. Upon comparing TBs derived from the dizygotic twins, before and after ZIKV infection, 96 known and six novel lncRNAs were found to be differentially expressed (DE) in infected TBs (FDR < 0.05). Co-expression network analysis revealed two modules with a significant positive correlation (0.99*** and 0.93**) with in vitro ZIKV infection of TB, comprising 10.8% of the DE lncRNAs, some classified as hub-genes. These modules showed enrichment for GO terms related to “regulation of defense response to virus”, “response to interferon”, amongst others. Notably, in ZIKV-infected TBs from microcephaly-affected twins, eight imprinted genes were detected as DEGs, including lncRNAs, such as H19 and MEG3. These findings highlight a global transcriptomic reprogramming upon hiPSC differentiation into TB and suggest that infection of TB with ZIKV dysregulates imprinted genes in microcephaly-affected twins, indicating a reduced capacity for cellular response and a mechanism of susceptibility to the severe neurological outcome. These data may support additional investigations aimed at identifying placental gene networks for a better understanding of the molecular basis of TB development and differentiation, and at identifying models that describe the expression profiles of different cell populations within this tissue.