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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.99.2020.tde-06022020-124608
Document
Author
Full name
Fabio Augusto Abreu de Almeida
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2019
Supervisor
Committee
Dinardo, Carla Luana (President)
Casseb, Jorge Simão do Rosário
Bub, Carolina Bonet
Cruz, Bruno Ribeiro
Title in Portuguese
Estratégias de busca de genótipos variantes do gene RHCE em doadores de sangue afrodescendentes
Keywords in Portuguese
Afrodescendentes
Biologia molecular
Doadores de sangue
Genética
Grupos sanguíneos
Polimorfismo
Abstract in Portuguese
Introdução: O sistema Rh é o maior e mais complexo sistema de grupos sanguíneos, sendo composto por 55 antígenos codificados pelos genes RHD e RHCE (lócus RH), que são altamente homólogos e pleomórficos. O lócus RH apresenta alta prevalência de rearranjos gênicos e mutações de ponto em população de ancestralidade africana, que é representada, na prática transfusional, principalmente pelos pacientes portadores da doença falciforme. Essas variações gênicas originam os alelos variantes de RH, que podem levar, entre outros efeitos, à expressão de antígenos parciais, com perda de epítopos imunogênicos, e à perda de expressão de antígenos de alta frequência do sistema Rh, predispondo os pacientes à aloimunização com eventual necessidade de transfusão de unidades provenientes de doadores raros com fenótipos Rh variantes ou Rh nulo. Objetivos: 1) Padronizar estratégia de rastreamento das variantes do gene RHCE mais frequentemente identificadas em população com doença falciforme dentre doadores de sangue brasileiros autodeclarados negros, visando a atender aos pacientes aloimunizados que necessitem de transfusões de unidades variante-idênticas ou negativas para antígenos de alta frequência do sistema Rh e 2) Avaliar se a inclusão do genótipo nulo do sistema Duffy (FY*02N.01/FY*02N.01) na seleção de doadores aumenta a eficácia de identificação de genótipos RH variantes. Metodologia: Foram selecionados 217 doadores de sangue autodeclarados negros com os fenótipos R1r e R0r. Em 214 amostras foi realizada a genotipagem do polimorfismo c.-67T>C da região promotora do gene FY (alelo FY*02N.01), que é informativo de ancestralidade africana e que, em homozigose, configura o genótipo Duffy nulo. Em seguida, foi realizada a amplificação e sequenciamento direto (método de Sanger) dos éxons 1, 5, 6 e 7 do gene RHCE, que contêm mutações chaves para as seguintes variantes: RHCE*ce.01, RHCE*ceVS.01, RHCE*ceVS.02, RHCE*ceVS.03, RHCE*ceVS.05, RHCE*ceAR, RHCE*ceEK, RHCE*ceMO, RHCE*ceCF, RHCE*ceTI e RHCE*ceSM. Os doadores portadores dos alelos RHCE*ceVS.03 ou RHCE*ceVS.05 foram submetidos a PCR multiplex para detecção do haplótipo hibrido (C)ceS. Resultados: Do total de doadores inclusos (n=217), 140 (140/217, 64,5%) apresentaram ao menos um alelo RHCE mutado. Os alelos variantes mais comuns foram: RHCE*ce.01 (55/434, 12,7%) e RHCE*ceVS.01 (54/434, 12,4%). Foram identificados 47 doadores (47/217, 21,6%) com genótipos RHCE de relevância clinica (codificando antígenos parciais ou ausência de antígenos de alta frequência) e, destes, doze doadores (12/217, 5,5%) apresentaram ausência de antígenos de alta frequência do sistema Rh (hrB ou hrS). Oito doadores (8/12, 66,6%) que apresentaram ausência de antígenos de alta frequência possuíam o genótipo Duffy nulo. Conclusões: A estratégia de selecionar doadores autodeclarados negros e com os fenótipos R1r e R0r mostrou-se viável e eficaz para identificar genótipos variantes de RHCE na população brasileira. A inclusão do genótipo Duffy nulo como critério de seleção dos doadores mostrou ser boa alternativa para a busca de genótipos que levam à perda de expressão de antígenos de alta frequência. Os doadores variantes de RHCE identificados poderão atender a demanda transfusional dos pacientes aloimunizados que necessitem de transfusões de unidades variante-idênticas ou negativas para antígenos de alta frequência do sistema Rh.
Title in English
Search strategy for variant RHCE genotypes gene in African descent blood donors
Keywords in English
African-descent
Blood donors
Blood groups
Genetics
Molecular biology
Polymorphism
Abstract in English
Background: Rh system is the largest and most complex blood group system, comprising 55 antigens encoded by the highly homologous and pleomorphic RHD and RHCE genes (RH locus). The RH locus has a high prevalence of gene rearrangements and point mutations among people of African descent, represented, in transfusion practice, mainly by patients with sickle cell disease. These gene variations give rise to RH variant alleles, which can lead, among other effects, to partial antigens, exhibiting loss of immunogenic epitopes; or to the loss of Rh high frequency antigens, predisposing patients to alloimmunization and to the possible need of red blood cell (RBC) units from rare donors with Rh variants or Rh null phenotype. Objectives: 1) Standardize a screening strategy for the most frequently identified RHCE gene variants among Brazilian blood donors self-reported as black, aiming to meet the transfusion needs of alloimmunized patients who require RBC units with variant Rh phenotype and 2) Evaluate whether the inclusion of the Duffy null genotype (FY*02N.01/FY*02N.01) as selection criteria increases the effectiveness of the screening protocol. Methodology: 217 blood donors self-reported as black and presenting R1r and R0r phenotypes were selected. Genotyping of the c.-67T>C polymorphism of the promoter region of the FY gene (FY*02N.01 allele), which is informative of African ancestry and which, in homozygosity, configures the Duffy null genotype, was performed in 214 samples. Sequencing (Sanger's method) of exons 1, 5, 6 and 7 of the RHCE gene was performed. These RHCE exons comprise key mutations for the following variants: RHCE*ce.01, RHCE*ceVS.01, RHCE*ceVS.02, RHCE*ceVS.03, RHCE*ceVS.05, RHCE*ceAR, RHCE*ceEK, RHCE*ceMO, RHCE*ceCF, RHCE*ceTI and RHCE*ceSM. Donors carrying the RHCE*ceVS.03 or RHCE*ceVS.05 alleles underwent multiplex PCR to detect the (C)ceS hybrid haplotype. Results: From the total donors included (n=217), 140 (140/217, 64.5%) had at least one mutated RHCE allele. The most common variant alleles were: RHCE*ce.01 (55/434, 12.7%) and RHCE*ceVS.01 (54/434, 12.4%). Forty-seven donors (47/217, 21.6%) with clinically relevant RHCE genotypes (coding partial antigens or absence of high frequency antigens) were identified, and of these, twelve donors (12/217, 5.5%) had absence of high frequency Rh antigens (hrB or hrS). Eight donors (8/12, 66.6%) who lacked high frequency antigens had the Duffy null genotype. Conclusions: The strategy of selecting self-declared black donors with R1r and R0r phenotypes proved to be viable and effective in identifying variant RHCE genotypes in Brazilian population. The inclusion of the Duffy null genotype as a donor selection criterion proved to be an effective alternative for the search for genotypes that lead to the loss of Rh high frequency antigens. The identified RHCE variant donors will compose a virtual bank of rare donors and will potentially meet the transfusion needs of alloimmunized patients requiring variant-identical RBC units.
 
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Publishing Date
2020-02-07
 
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