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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.99.2016.tde-19042016-145530
Document
Author
Full name
Juliana Vieira dos Santos Bianchi
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2016
Supervisor
Committee
Sabino, Ester Cerdeira (President)
Dinardo, Carla Luana
Casseb, Jorge Simão do Rosário
Levi, José Eduardo
Pinho, João Renato Rebello
Title in Portuguese
Genotipagem de grupos sanguíneos por meio de microarranjos líquidos
Keywords in Portuguese
Bancos de Sangue
Genótipos
Grupos sanguíneos
Abstract in Portuguese
Os sistemas de grupos sanguíneos eritrocitários e plaquetários têm grande importância na medicina transfusional. Os serviços de hemoterapia têm investido cada vez mais em protocolos profiláticos à aloimunização contra antígenos eritrocitários, sendo o surgimento das plataformas de genotipagem em larga escala um avanço muito importante nesse âmbito. Este estudo tem por objetivo a padronização e a validação da plataforma OpenArray, por meio da técnica de microarranjos líquidos para genotipagem de antígenos eritrocitários e plaquetários em larga escala para futura implementação na rotina de doadores de sangue. Tal genotipagem permitirá a análise da frequência genotípica encontrada nos doadores de sangue da Fundação Pró-sangue/Hemocentro de São Paulo. Métodos: Foram analisadas 400 amostras de sangue total coletadas de doadores de sangue entre outubro e novembro de 2011. A genotipagem dos polimorfismos de troca de um nucleotídeo (Single nucleotide polymorphism - SNPs) que codifica os principais antígenos eritrocitários e plaquetários de relevância transfusional foi realizada utilizando a tecnologia OpenArray para as 400 amostras. Dessas, 242 também foram analisadas pela plataforma de genotipagem BLOODchip, em larga escala. Procedeu-se à comparação entre as técnicas em termos de acurácia, reprodutibilidade, número de resultados incorretos, número de resultados não amplificados ou indeterminados, possibilidade de customização dos ensaios, tempo total de duração da reação e número de amostras processadas por bateria. Foi também calculada a frequência genotípica dos SNPs e feita a comparação com dados prévios de literatura. Resultados e discussão: as amostras que foram testadas em ambas as plataformas apresentaram acurácia de 99,9% pela técnica OpenArray e 100% pela técnica BLOODchip, sendo os resultados discrepantes analisados por sequenciamento direto (técnica Sanger), confirmando os resultados obtidos pela genotipagem realizada no BLOODchip. Além disso, a técnica OpenArray apresentou maior número de resultados não amplificados ou indeterminados (no call), o que representa uma grande desvantagem do método, em decorrência da perda de insumos. Entretanto, a técnica OpenArray apresentou outras vantagens em relação ao BLOODchip, como a possibilidade de customização do ensaio, menor tempo para processamento das amostras, considerando a possibilidade de automatização total do processo e número de amostras testadas por bateria superior ao método comparativo. Os resultados da frequência alélica e genotípica dos polimorfismos analisados pelo método OpenArray foram comparados com as frequências encontradas na literatura, observando-se prevalência de doadores com perfil genotípico mais próximo da população caucasoide, porém, com a presença de alelos encontrados na população negra. Entretanto, esse perfil genotípico dos doadores predispõe à aloimunização de doentes falciformes, com perfil fenotípico negroide, reiterando a necessidade de transfusões com fenótipo compatível como profilaxia à aloimunização.
Title in English
Genotyping of the blood groups using liquid microarrays
Keywords in English
Blood Banks
Blood Groups
Genotypes
Abstract in English
The erythrocyte and platelets blood groups are extremely important for transfusional medicine. Hemotherapy services have increasingly invested in prophylactic protocols for alloimmunization against erythrocyte antigens and the emergence of high-throuput genotyping platforms are a very prominent advance in this area. The aim of this study was to validate and to standardize the OpenArray platform, which is based on the microarray technolgy for the erythrocyte antigens genotyping on large scale, to further implementation in blood bank routine. This tecnique also allowed to asses the genotype frequencies in blood donors from Fundação Pró-sangue/Hemocentro de São Paulo. Method: We examined 400 blood donor samples collected from October to November 2011. The SNPs were detected using OpenArray technology. From the 400 blood samples, 272 were also tested using BLOODchip platform, to compare the results between both tecniques and evaluate the accuracy, reproducibility, number of incorrect results, failed samples, possibility of assays customization, duration of procedures, and number of samples that can be processed per batch. The genotype frequency of SNPs was also assesed and the findings were compared to previous studies. Results and Discussion: the OpenArray method showed accuracy of 99.9% and the BLOODchip of 100%. The inconsistent results were confirmed by Sanger Sequencing which showed that BLOODchip analysis was accurate. Besides, the OpenArray method showed a higher number of non-amplification or failed results (no call), which may be a major disavantage, due to reagent loss. However, the OpenArray platform showed other advantages when compared to BLOODchip such as the possibility of assay customization and full automation of the process, it was less time-consuming and allowed a higher number of samples per batch. The genotypic and allelic frequencies of each SNP tested in the blood donor population were calculated by the OpenArray method and the results were compared to reports from previous studies. We observed a prevalence of genotypic profiles closest to the Caucasian population, however, there was the presence of alleles found in the black population as well. This genotypic profile donors predispose to alloimmunization of sickle cell patients, with negroid phenotypic profile, reiterating the need for compatible phenotype transfusions and prophylaxis to alloimmunization.
 
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Publishing Date
2016-04-19
 
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