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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.99.2017.tde-23022017-112204
Documento
Autor
Nome completo
Marcos Luiz Alves Andrino
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2016
Orientador
Banca examinadora
Okay, Thelma Suely (Presidente)
Galisteo Junior, Andrés Jimenez
Hiramoto, Roberto Mitsuyoshi
Kashino, Suely Sanae
Título em português
Padronização e validação de dois sistemas de amplificação quantitativa para a detecção do DNA mitocondrial e nuclear de Trypanosoma cruzi, em amostras sanguíneas e teciduais de camundongos Swiss infectados
Palavras-chave em português
Biologia molecular
DNA de cinetoplasto
Doença de Chagas
Modelos animais
Reação em cadeia por polimerase
Trypanosoma cruzi
Resumo em português
As técnicas sorológicas são os testes de referência para o diagnóstico da doença de Chagas, porém, são pouco efetivas para avaliar a resposta ao tratamento, uma vez que a soronegativação pode levar muitos anos. As sorologias também são usadas para identificar episódios de reativação em pacientes com algum grau de imunodeficiência, por exemplo, os co-infectados pelo HIV. Já a hemocultura e o xenodiagnóstico possuem elevada especificidade e baixa sensibilidade, requerendo de 30 a 120 dias para a liberação do resultado final, podendo gerar resultados falso-negativos especialmente na fase crônica da infecção. Diante disso, a PCR em tempo real (qPCR), técnica com elevada sensibilidade e especificidade, poderia ser utilizada para detectar e quantificar a carga parasitária, permitindo o diagnóstico de episódios de reativação e o monitoramento de pacientes em tratamento. A escolha dos alvos de amplificação e dos iniciadores da qPCR é desafiadora, já que ainda não existe consenso na literatura sobre a melhor sequência alvo de amplificação e os melhores iniciadores. No presente estudo, foram selecionados iniciadores do DNA nuclear (F2/B3) e do mitocondrial (32F/148R) de T. cruzi. Posteriormente, para validação dos ensaios, foram obtidas amostras de sangue, cérebro, coração, pulmão, fígado, baço, rim, intestino, glândulas adrenais, tecido adiposo e tecido muscular esquelético de 24 camundongos Swiss adultos, infectados intraperitonealmente com 103 formas tripomastigotas da cepa Y de Trypanosoma cruzi. Amostras foram colhidas no 13º, 26º e 61º dias pós-infecção, correspondendo a diferentes intensidades de carga parasitária (alta, média e baixa). As amostras foram analisadas por qPCR com SYBR Green. Os resultados mostraram que os iniciadores do DNA nuclear e mitocondrial detectaram T. cruzi de forma específica, sendo que as maiores cargas parasitárias foram detectadas pelos iniciadores do DNA nuclear, embora os iniciadores do DNA mitocondrial tenham apresentado maior sensibilidade analítica (0,002 e 0,0002 de um único parasito, respectivamente). As duas qPCR obtiveram índices adequados de reprodutibilidade e repetibilidade inferiores a 25%. Os parâmetros de eficiência, (90%- 110%) e linearidade (R2 >= 0.98) das duas qPCR apresentaram valores adequados de acordo com o estabelecido pela literatura especializada. A comparação do threshold cycle (CT) das duas qPCR não apresentou diferença estatística. Em relação à carga parasitária foi possível detectar o DNA do parasito em todas as amostras de sangue e tecidos, com distribuição universal, porém heterogênea, e em todas as fases da infecção. O modelo animal utilizado neste estudo foi adequado para validar as duas qPCR voltadas à detecção e quantificação da carga parasitária. De acordo com os parâmetros estabelecidos, as duas qPCR, com iniciadores do DNA nuclear e do mitocondrial, foram padronizadas e validadas com sucesso, sendo capazes de quantificar todos os tipos de amostras (sangue e órgãos), nas fases aguda, subaguda e crônica da doença, sinalizando positivamente para a utilização dos dois ensaios moleculares no diagnóstico da infecção por T. cruzi.
Título em inglês
Two quantitative amplification systems for detection of mitochondrial and nuclear DNA of Trypanosoma cruzi: standardization and validation in the blood and tissue samples from infected Swiss mice
Palavras-chave em inglês
Animal model
Chagas disease
Fluorescence
Kinetoplast DNA
Molecular biology
Polymerase chain reaction
Trypanosoma cruzi
Resumo em inglês
Serological techniques are the gold standards for the diagnosis of Chagas' disease, but are not very effective in evaluating the response to treatment, since seronegativation may take many years. Serology is also used to identify reactivation episodes in patients with some degree of immunodeficiency, for example those co-infected with HIV. Hemoculture and xenodiagnosis have high specificity and low sensitivity, requiring 30 to 120 days for releasing a final result, and they can generate false-negative results especially in the chronic phase of infection. Therefore, real-time PCR (qPCR), a technique with high sensitivity and specificity, could be used to detect and quantify the parasite load, allowing the diagnosis of reactivation episodes and the monitoring of patients undergoing treatment. The choice of amplification targets and qPCR primers is challenging since there is as yet no consensus in the literature about the best amplification target sequence and the best primers. In the present study, primers from the nuclear (F2/B3) and mitochondrial, kDNA (32F/148R) T. cruzi sequences were designed. Samples were obtained from the blood, brain, heart, lung, liver, spleen, kidney, intestine, adrenal glands, adipose tissue and skeletal muscle tissue of 24 adult Swiss mice, infected intraperitoneally with 103 trypomastigote forms of the Y strain of Trypanosoma cruzi. The samples were collected at the 13th, 26th and 61st post-infection days, corresponding to different parasite load levels (low, medium and high), and were analyzed by qPCR with SYBR Green. The results showed that the nuclear and mitochondrial DNA primers detected T. cruzi DNA in a specific way. The nuclear primers detected higher parasite load levels than the kDNA ones, although the kDNA primers presented higher analytical sensitivity (0.002 and 0.0002 of a single parasite, respectively). The two qPCRs showed adequate reproducibility and repeatability indexes, i.e., below 25%. The efficiency parameters, (90% - 110%) and linearity (R2 >=0.98) of the two qPCRs showed adequate values according to the established literature. The comparison of the threshold cycle (CT) of the two qPCRs found no statistical difference. Regarding the parasite load, it was possible to detect the parasite DNA in all blood and tissue samples, with universal distribution, however heterogeneous, and at all stages of infection. The animal model used in this study was adequate to validate the two qPCRs for the detection and quantification of the parasite load. According to established parameters, the two qPCRs, with nuclear and mitochondrial primers, were successfully standardized and validated, being able to quantify all types of samples (blood and organs), in the acute, subacute and chronic phases of the disease, signaling positively to the use of both molecular assays in the diagnosis of T. cruzi infections.
 
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Data de Publicação
2017-02-24
 
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